1、第 七 章 手 性 色 譜,姚 舜,高效分離技術(shù)（HPLC）,小顆粒+高壓高速=高效,三要素：被分離物、固定相、流動相,高效手性分離技術(shù),色譜法和電泳法是一類高效分離方法，但常規(guī)的色譜/電泳方法仍不能直接分離對映體。（為什么？） 因?yàn)樵诜鞘中原h(huán)境中，對映體的分離性質(zhì)（如沸點(diǎn)、蒸氣壓、溶解度、分配系數(shù)、吸附特性以及淌度）完全相同。 如何運(yùn)用高效色譜和毛細(xì)管電泳分離分析對映體化合物？ 熱力學(xué)/分離性質(zhì)上的差異,手性分離基本策略,手性消除 采用手性試劑衍生對映體，使之轉(zhuǎn)化為非對映體，利用非對映體間的性質(zhì)差異采用常規(guī)分離方法分離。 構(gòu)建手性分離環(huán)境 將手性分離介質(zhì)引入分離器中構(gòu)建手性分離環(huán)境，使得原本

2、沒有分離性質(zhì)差異的對映體產(chǎn)生分離差異。 結(jié)合高效分離技術(shù),7-1 手性色譜技術(shù)概述,7-1-1 色譜技術(shù)分類藥物研究、開發(fā) 對手性色譜技術(shù)的需求,手性藥物研發(fā)不同階段對單一手性物的需求,在新藥研究、開發(fā)的不同階段，對于制備單一手性物的需要及相關(guān)因素各不相同。,7-1-2 色譜技術(shù)分類,采用手性衍生化試劑與手性胺類、醇類、羧酸類等反應(yīng)形成非對映體衍生物。非對映體對在常規(guī)色譜系統(tǒng)中,根據(jù)非對映體分子的手性結(jié)構(gòu)、手性中心所連接的基團(tuán)、色譜系統(tǒng)的分離效率(包括溶質(zhì)分子與固定相和溶劑之間的結(jié)合力,如氫鍵、偶極-偶極、電荷轉(zhuǎn)移和疏水性等 )的不同,而差速遷移獲得分離。,1間接法（）,與直接法相比 ,手性衍

3、生化試劑法的優(yōu)點(diǎn),(1)使用普通的色譜柱方法成本低,分離方法靈活(可以選擇正相、反相以及梯度淋洗等技術(shù)),且易于優(yōu)化；,(2)由于手性衍生化試劑()分子中一般含有紫外、熒光等可檢測基團(tuán),故方法靈敏度較高；,(3)有種類較多的可供選擇的手性衍生化試劑(其中有些已經(jīng)商品化),適用面較廣。選用不同光學(xué)異構(gòu)體的手性衍生化試劑,可改變對映體 (衍生產(chǎn)物 )的柱后流出序。 常能在大量的一種對映體存在下分離和測定微量的另一種對映體。,法的缺點(diǎn),(1) 往往會出現(xiàn)消旋化問題；,(2) 需進(jìn)行衍生化操作步驟,較費(fèi)時；,(3) 要求手性衍生化試劑較高的純度。,(4) 手性化合物對映體的化學(xué)結(jié)構(gòu)中應(yīng)具有易于衍生化的

4、基團(tuán) 如氨基、羧基、羥基和巰基等活潑氫基團(tuán)。,胺、酸和醇類手性衍生化反應(yīng)的主要類型,手性衍生化試劑及反應(yīng),1. ?；噭??；噭┦怯婶人嵫苌模话闶中蕴荚游挥隰然奈?，主要用于分離胺和醇類。 應(yīng)用形式： 酸酐和酰氯等,其中酰氯的反應(yīng)性最強(qiáng)，即使是仲胺、仲羥基也能反應(yīng)，但性質(zhì)欠穩(wěn)定。酸酐的反應(yīng)性次之，可由羧酸與光氣制備。,例如將氰醇酰化生成Mosher酯后，可用GC或HPLC進(jìn)行分離測定。苯乙醇氰Mosher酯可用毛細(xì)管氣相色譜（Durabond DB-5 ，0.330 m柱)分離測定；而4-甲氧基苯乙醇氰Mosher酯可用高效液相色譜（Nucleosil 100-5柱）分析。,外消旋樣品

5、,手性衍生劑,非對映體，揮發(fā)性和吸附特性有差異,(-)-A(-)-B / (+)-A(-)-B,實(shí)例：,2. 胺類試劑 主要用途：衍生化羧酸類、N保護(hù)氨基酸、醇類藥物和芳基丙酸類非甾體抗炎藥、烴基丙三醇、類萜酸等。,3. 異(硫)氰酸酯類 主要用途：分離胺和醇類對映體。這類試劑與胺反應(yīng)生成脲，與醇反應(yīng)生成氨基甲酸酯類，反應(yīng)通常在CH2Cl2、甲苯、CHCl3中進(jìn)行。,4. 氯甲酸酯類 這類試劑與伯、仲胺在中等堿性的水溶液中反應(yīng)生成氨基甲酸酯;與硫醇和酚反應(yīng)則生成巰基碳酸酯和碳酸酯。,5.鄰苯二醛(OPA)和手性硫醇 OPA在硫醇存在下，可將胺類衍生化生成異吲哚類。這類衍生物通常都具有強(qiáng)烈熒光和

6、良好的分離度。,手性衍生化分離機(jī)制,非對映體對衍生物是否具有良好的分離度，衍生化反應(yīng)是否具有較高的選擇性，主要取決于手性試劑的選擇、反應(yīng)產(chǎn)物手性基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)生成的化學(xué)鍵類型。,對映體對在色譜系統(tǒng)中的差速遷移與下述因素有關(guān)：,非對映體分子的手性結(jié)構(gòu); 手性中心所連接的基團(tuán)； 色譜系統(tǒng)的分離效率包括溶質(zhì)分子與固定相和溶劑之間的結(jié)合力如氫鍵、偶極偶極、電荷轉(zhuǎn)移和疏水性等。 手性中心區(qū)域有環(huán)系統(tǒng)或剛性結(jié)構(gòu)，這些均可增加對映體對衍生物的分離度。 反應(yīng)產(chǎn)物間的構(gòu)型差異越大，分離就越容易。,2直接法,直接法可以分為兩類:,手性流動相添加劑法(CMPA) 好比一只腳穿高跟鞋 一只腳穿平底鞋 （鞋和腳都在動

7、） 手性固定相法(CSP) 好比一只腳走在泥地 一只腳走在旱地 （地不動）,在液相色譜流動相或毛細(xì)管電泳的緩沖溶液中加手性添加劑（CA），CA與對映體溶質(zhì)通過靜電引力和氫鍵等非共價鍵結(jié)合方式，形成可逆的不同穩(wěn)定性的非對映體配合物，在非手性分離器中實(shí)現(xiàn)對映異構(gòu)體的分離。 手性添加劑是一種直接拆分法，其優(yōu)點(diǎn)在于不需要化學(xué)衍生，也不需要特殊的手性固定相。CA必須能提供有效的基團(tuán)和位置以便與溶質(zhì)對映體形成非對映的配合物，也必須具有合適的結(jié)構(gòu)以改善分離性能和提高其立體選擇性。 常見的CA可分為手性對離子添加劑、手性配位添加劑和環(huán)糊精添加劑。,（1）手性流動相添加劑法,手性流動相添加劑液相色譜法,1).手

8、性包含復(fù)合色譜法,經(jīng)常采用的添加劑是環(huán)糊精和手性冠醚。 、環(huán)糊精(CDs)分別為6，7，8個D-(+)吡喃型葡萄糖組成的環(huán)狀低聚糖，其分子呈上寬下窄、兩端開口、中空的筒狀物，腔內(nèi)部呈相對疏水性，而所有的羥基則在分子外部，其結(jié)構(gòu)見圖7-10。,圖7-10 、環(huán)糊精結(jié)構(gòu),疏水包合區(qū) 極性作 用區(qū),6，7，8,CDs在高效液相色譜法(HPLC)中的應(yīng)用主要有化學(xué)鍵合的CD硅膠固定相法(CSP)及作為反相系統(tǒng)的手性流動相添加劑法(CMPA)。兩者中不同對映體流出順序相反。 應(yīng)用特點(diǎn)： 前者簡便有效，但價格昂貴；后者雖不及前者效果好，但價廉易行，不需特殊分析柱，兩法可相互補(bǔ)充。,CDs的這種結(jié)構(gòu)使其具有

9、能與各種極性和非極性分子、離子形成包含復(fù)合物(inclusion complexes)的獨(dú)特性質(zhì)。分子中多個手性中心使CDs絡(luò)合作用具有高度立體選擇性，可作為選擇性拆分各種異構(gòu)體的方法。,CDs作為CMPA還有一些重要性質(zhì)，包括： 在溶液中CDs的包含作用不僅是立體選擇性的，而且是可逆的； 復(fù)合物形成的速率常數(shù)與可控的擴(kuò)散過程的速率常數(shù)通常為同一級，故其在溶液中的平衡相對較快，這一點(diǎn)很重要； 在較寬pH范圍內(nèi)CDs分子是穩(wěn)定的；不干擾U檢測，在通常用于色譜檢測的全部紫外檢測波長范圍內(nèi)無吸收； CDs無毒性。,CDs作用的基本原理 在含有CDs為流動相組分的反相系統(tǒng)中的復(fù)合與吸附平衡比較復(fù)雜，影

10、響對映體拆分的因素主要有： CD復(fù)合物穩(wěn)定常數(shù)的差異； CD復(fù)合物在疏水固定相表面吸附的差異； 溶質(zhì)分子(對映體)與吸附在反相柱表面的CD層上的吸附程度的差異。,實(shí)例：-CD拆分苯基琥珀酸,15 mmol/L-CD + 3% CH3CN + 0.05 %CF3COOH,0.30 mmol/L (2,3,6-3-OCH3) -CD +16%CH3CN +0.05%CF3COOH,Nova-pak C18色譜柱,應(yīng)用CD添加劑法還分離了叔丁喘寧、環(huán)己巴比妥和氯噻酮對映體,圖712 CD添加劑法分離,2).手性配合交換色譜法,常用的手性配合試劑多為氨基酸及其衍生物， 如L - 脯氨酸 、L - 苯丙

11、氨酸等。它們的光學(xué)純度高， 易與過渡金屬配位。配位金屬有C u 、Z n 、N i、C d等。,配合物在生物系統(tǒng)中具有非常重要的作用， 如氨基酸和肽類的金屬配合復(fù)合物、 酶- 金屬- 底物配合物等。1979年Davankov將手性金屬配合劑加入HPLC流動相中， 形成三元非對映體配合物。 由于它們結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和能量的差異， 并與固定相發(fā)生立體選擇性吸引或排斥反應(yīng)， 使兩對映體得以分離。,3).手性離子對色譜法,基本原理： 在低極性的有機(jī)流動相中， 對映體分子與手性離子對試劑之間產(chǎn)生靜電， 氫鍵或疏水性反應(yīng)對映體離子對。兩種非對映體離子對具有不同的穩(wěn)定性， 并且在有機(jī)相與吸附固定相間的分配行為也有

12、差異， 因而得以分離。,常用的手性反離子有奎寧、 奎尼丁、 1 0 - 樟腦磺酸、 N-苯 甲酰氧基 羰基- 甘氨酰- L - 脯氨酸 L -Z G P。 被分離的藥物有阻滯劑、 奎寧、 奎尼丁、 梭酸、 磺酸、 甲氟嗪、 苯丙酰苯心安等。 使用的固定相有硅 膠 ， C N , D i o l,B-： 被拆分的手性有機(jī)堿，（S）- H A+： 手性反離子,HPLC-CMPA拆分對映體的機(jī)理大致可歸納為：, 于流動相中發(fā)生立體選擇性反應(yīng)，如包含、配合交換、離子對等； 手性添加劑吸附到固定相表面，形成動態(tài)的液體手性固定相； 形成在流動相與固定相間具有不同分配性質(zhì)或欠穩(wěn)定的非對映體復(fù)合物。,總結(jié),(

13、2)手性固定相液相色譜法,手性固定相具有很強(qiáng)的特征性，一個固定相往往只能拆分一類或幾類對映體。 手性色譜的另一個特點(diǎn)是將手性固定相變成相反構(gòu)型，可能會使對映體洗脫順序顛倒過來。 研制新的手性固定相，解決不同類型手性化合物的分離是手性色譜發(fā)展的前沿領(lǐng)域。,過去100年：拆分約7000種手性化合物 手性色譜：已拆分近萬種手性化合物 液相色譜中的手性固定相已研制100多種,常見手性固定相分類 選擇基鍵合相（Pirkle手性固定相） 纖維素和多糖衍生物 環(huán)糊精 蛋白質(zhì)鍵合相 合成聚合物與分子烙印手性固定相,拆分機(jī)理：氫鍵、-鍵、偶極-偶極、包合絡(luò)合物、配位交換、疏水和極性相互作用的偶合。,主要優(yōu)缺點(diǎn),

14、優(yōu)點(diǎn)是： 能廣泛適用于各類化合物，適于常規(guī)及生物樣品的分析測定； 除非必須衍生化，否則無需高光學(xué)純度試劑； 樣品處理步驟簡單。 制備分離方便，定量分析的可靠性較高； 缺點(diǎn)是： 樣品有時也須作柱前衍生（但不一定是手性衍生化試劑）， 對樣品結(jié)構(gòu)有一定限制，其適用性尚不及普通HPLC固定相（包括正相和反相）那樣廣泛。 迄今為止，CSP柱商品已有40多種，價格大多昂貴，尚未有一種具有類似ODS柱的普遍適用性。,Lux Amylose-2 Chiral column,（1） Pirkle型手性固定相,它以創(chuàng)始者美國Illinois大學(xué)的Pirkle W.H.研究組命名，也稱-類型或Brush-Type(

15、刷型)?！八⑿汀笔中怨潭ㄏ?(Brushtype CSP) 是HPLC手性固定相中非常重要的一類，這類CSP一般通過一定的間隔臂，連接一個單分子層的手性有機(jī)分子到硅膠載體上而制得，因而被稱之為“刷型”CSP。 它是手性液相色譜領(lǐng)域使用量大，適用面廣，對手性識別機(jī)理揭示較深的一類重要的CSPs。,手性固定相與手性拆分機(jī)理,此類手性手性固定相化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)是手性中心附近至少含有下列一種官能團(tuán)： -吸電子或-給電子的芳香基團(tuán)（在手性識別過程中發(fā)生-電荷相互作用）； 能形成氫鍵的原子或基團(tuán)； 能發(fā)生偶極-偶極相互作用的極性鍵和基團(tuán)； 能提供立體排斥、范德華相互作用和構(gòu)型控制較大的非極性基團(tuán)。,手性固定

16、相與手性拆分機(jī)理,拆分機(jī)理 三點(diǎn)作用原理 在手性固定相與對映體的識別過程中，至少需要兩個不同的力，使對兩映體按照同一空間取向吸附在固定相上，而由于對映體空間構(gòu)型的不同，使得第三個力（吸引力或排斥力）作用不同，導(dǎo)致吸附能的不同，得到不同的保留值而分開。,三點(diǎn)作用模型,相互作用強(qiáng)，保留長，后出峰,相互作用弱，保留短，先出峰,(S)-選擇子,(R)-溶質(zhì),手性識別的“三點(diǎn)作用” 模型,相似的相互作用力(A-A, B-B)導(dǎo)致色譜手性識別能力的降低或消失,對映體與CSP的三個作用力中，至少有一個力具有立體選擇性即依賴于對映異構(gòu)體和CSP的立體化學(xué)，而另外兩個作用力必須是兩種不同類型的作用力，如氫鍵、偶

17、極作用、作用等，否則如果存在兩個相同的作用力，則可能產(chǎn)生不利的作用，使得CSP的手性識別能力降低或消失。例如當(dāng)A-A和B-B作用力相同時，就可能使CSP失去手性分離能力(下圖)。,Pirkle型手性柱分為酰胺型和脲型CSP兩種結(jié)構(gòu)。它一般用于正相色譜體系，以含一定量異丙醇（0.220%）的正己烷為流動相，有時也采用四氫呋喃和其它氫鍵受體溶劑。它也用于反相體系分離強(qiáng)極性溶質(zhì)。 Pirkle型CSP的優(yōu)點(diǎn)是柱效和柱容量高。,壓 力,原 則,色譜柱評價,1.理論板數(shù)（甲苯） 出峰時間：2.731， 半峰高：0.11 理論板數(shù)：11036.22*4=44144.88,色譜柱評價,2.對苊的拆分能力 色

18、譜條件：流動相為正己烷：異丙醇=90：10，流速1ml/min，柱溫30 進(jìn)樣量15l 出峰時間：11.4min，14.5min,2月19日 2月25日 3月14日,進(jìn)而進(jìn)行熱力學(xué)、動力學(xué)深度考察,7-4-2 蛋白質(zhì)固定相,蛋白質(zhì)含手性氨基酸，具較大的分子量和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，可提供許多不同的手性鍵合部位，利用蛋白質(zhì)分子與對映體之間的立體選擇性結(jié)合能將對映體分離出來。 主要有酸糖蛋白(AGP)、牛血清白蛋白(BSA)、卵粘蛋白(OVM)等，本類色譜柱通?？砂捶聪喾绞讲僮?，流動相的PH、離子強(qiáng)度、有機(jī)改性劑的極性和濃度、溫度對于對映體的保留時間和立體選擇性有較大的影響。,BSA,蛋白質(zhì)固定化的方法 （

19、1）吸附法，即將蛋白質(zhì)直接吸附在硅膠載體上作為CSP （2）化學(xué)鍵合法,蛋白質(zhì)類手性固定相應(yīng)用范圍較廣，效果良好，但該類固定相的譜柱容量較小。常用洗脫系統(tǒng)是磷酸鹽緩沖溶液（PH47），離子強(qiáng)度為 0500mmol，有機(jī)改性劑不得超過 5% 蛋白質(zhì)怕有機(jī)溶劑。,纖維素是D（+）-葡萄糖單元由1，4-糖苷鍵形成的高度有序、呈螺旋型孔穴結(jié)構(gòu)的光學(xué)活性高分子。但天然的纖維素手性拆分能力不高，色譜性能也不好，難于直接由于對映體拆分。,引入新基團(tuán),對纖維素和多糖等天然手性高分子進(jìn)行衍生改性，可制備性能優(yōu)良的手性固定相。 三種形式：凝膠顆粒；鍵合固定相和硅膠涂漬。 在目前在手性液相色譜中，纖維素及其衍生物大

20、多涂漬在硅膠上使用。日本Diacel公司大量提供這類商品手性色譜柱。,7-4-3 纖維素和多糖衍主物手性固定相,如纖維素三酯衍生物，如三苯基氨基酯涂敷在大孔硅膠上用作手性固定相，能直接分離許多對映體。聚多糖的空間結(jié)構(gòu)是具有一定方向的螺旋結(jié)構(gòu)。 這種結(jié)構(gòu)使得聚多糖表面布滿了凹陷。其手性識別主要來自氨基甲酸酯或酯的部位與被拆分物之間形成氫鍵或偶極-偶極作用，或通過被拆分物分子立體選擇性地進(jìn)入這些溝槽和孔穴。,纖維素CSP用水或非水溶性溶劑作流動相，除少數(shù)例外，適用的有機(jī)溶劑限于正己烷、異丙醇、甲醇、乙醇。流動相影響對映體分離的選擇性，非極性溶劑通常比甲醇/水混合液顯示出更高的分離選擇性。 這類CS

21、P具有應(yīng)用范圍廣，樣品容量高的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是柱效低，有些溶質(zhì)顯示不可逆吸附，且多為涂漬柱，較易流失，對所用溶劑有一定限制。已報道分離氨基酸、醇、酮及各種手性藥物的8085%是使用OD、OJ和AD柱.,表7-3 纖維素和多糖衍生物手性固定相,拆分外消旋1-苯基乙醇類化合物,三苯甲酸酯纖維素手性色譜柱（CHIRACEL OB ，I.D. 4.6250mm）拆分1-苯基乙醇、1-苯基丙醇、2-氯-1-苯基乙醇和2-溴-1-苯基乙醇外消旋化合物，可用于監(jiān)測不對稱催化氫化反應(yīng)過程和測定產(chǎn)物對映體過剩值。（廈門大學(xué)學(xué)報，1998，37（2）：309）,R：H，Cl，Br，CH3,實(shí)例：,7-4-8/9 合成

22、聚合物與分子烙印手性固定相,合成手性聚合物CSP的制備主要通過三種途徑： （1）在手性條件下不對稱聚合； （2）采用手性單體； （3）手性分子烙印技術(shù)。 分子烙印(imprinting)手性固定相是在聚合過程中加入一個適當(dāng)?shù)哪０?template)分子，然后從聚合物中除去模板分子，流下一個“形狀選擇性”(shape selectivity)孔穴，形成適合于孔穴立體選擇的聚合物。,GC & TLC & CE手性拆分,CSP、CMPA、CDR 各舉一例,氣相手性色譜,早期的手性固定相多使用氨基酸、肽和各種他們的衍生物，后來也有使用其他的天然的手性分子如酒石酸、蘋果酸、扁桃酸和菊酸，但是用環(huán)糊精衍生物制備的手性GC毛細(xì)管柱是最為成功的一類。 Armstrong 研究組在上世紀(jì)90年代初研究設(shè)計了一種既是液體又是極性的親水性糊精衍生物，做GC手性固定相。制備成在室溫下為液體、中等極性的 -，-，和-CD 的衍生物GC固定相。,O-(S)-2-羥丙基)-環(huán)糊精全甲基衍生物的制備,第一步：制備O-(S)-2-羥丙基)-環(huán)糊精首先把環(huán)糊精溶解在氫氧化