1、培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌,一. 實驗目的,明確培養(yǎng)基的配制原則； 掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟； 了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應用范圍； 掌握高壓蒸汽滅菌技術，了解幾種常用滅菌方法。 熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關準備工作及操作方法。,二. 實驗材料,藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂等。 儀器：高壓蒸汽滅菌器、恒溫干熱滅菌箱。,其它：天平、牛角匙、電爐、1N NaOH、pH試紙、 刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、 帶玻璃珠的三角瓶、帶棉塞的無菌試管、 無棉塞的空試管、培養(yǎng)皿、吸管、 各種包裝紙、防水紙、繩索、棉花、標簽等,（一）培養(yǎng)基的制備 （1）培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生

2、長繁殖和合 成代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物質的混合物。培養(yǎng)基的原材 料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水。根據(jù)微 生物的種類和實驗目的不同，培養(yǎng)基也有不同的種類和 配制方法。 （2）制備流程： 稱量溶解蒸煮調pH分裝包扎滅菌,三. 實驗原理,(3)操作步驟： 1）稱藥品 按實際用量計算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨后放人熱水中，牛肉膏便與稱量紙分離，立即取出紙片。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。 2）加熱溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補充水分至所需量。若配制固體

3、培養(yǎng)基，則將稱好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，此過程中需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補足所失的水分。,3）調pH 檢測培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴1molL-1NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙檢測，直至達到所需pH范圍。若偏堿，則用1molL-1HCl進行調節(jié)。pH的調節(jié)通常放在加瓊脂之前。應注意pH值不要調過頭，以免回調而影響培養(yǎng)基內各離子的濃度。 4）過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利結果的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，該步可省略。,固體分裝,5）分裝 披實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內。分裝時可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾

4、在管口或瓶口上面造成污染。 分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的15，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內以不超過其容積的一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜。滅菌后垂直待凝。,液體分裝,試管,三角燒瓶,試管,三角燒瓶,1/3,1/4,1/2,1/5,1/2,6）加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長約35塞入試管口或瓶口內，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。 7）包扎 加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛

5、皮紙，以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。 8）培養(yǎng)基的滅菌時間和溫度，需按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進行，以保證滅菌效果和不損培養(yǎng)基的必要成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放37溫室培養(yǎng)24h，無菌生長者方可使用。,培養(yǎng)基分裝,斜面制作,包扎成捆掛標簽,（4）關鍵步驟及注意事項 要嚴格按配方配制。 調pH不要過頭。 干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時間控制，70C以下放物、取物。 高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱后排除冷空氣，到時降壓回零取物。,（二）滅菌 滅菌：用物理或化學的方法殺滅物體上一切微生物。 （1）干熱滅菌法：把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫 至160C，恒溫1小時即可。此法適用于玻璃皿、金

6、屬用 具等的滅菌。 （2）高壓蒸汽滅菌法（一般121C，30min，適用培養(yǎng)基）： 把待滅菌的物品放在一個可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進 行的，以大量蒸汽使其中壓力升高。由于蒸汽壓的上 升，水的沸點也隨之提高。在蒸汽壓達到1.055 公斤/厘 米2時，加壓蒸汽滅菌鍋內的溫度可達到121C。在這種 情況下，微生物（包括芽孢）在1520 分鐘便會被殺 死，而達到滅菌目的。如滅菌的對象是砂土、石蠟油等 面積大、含菌多、傳熱差的物品，則應適當延長滅菌時 間。,高壓蒸汽滅菌法 1加水 將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的 水，以水面與三角架相平為至。 2裝料 將裝料桶放回鍋內，裝入待滅菌的物品。裝有培

7、養(yǎng)基的容器放置時要防止液體溢出，瓶塞不要緊貼桶 壁，以防冷凝水沾濕棉塞。 3加蓋 將蓋上與排氣孔相連接的排氣軟管插人內層滅菌 桶的排氣槽內，擺正鍋蓋，對齊螺口，然后以同時旋緊 相對的兩個螺栓的方式擰緊所有螺栓，并打開排氣閥； 4排氣 加熱。待水煮沸后，水蒸汽和空氣一起從排氣孔 排出。一般認為，當水沸后約5min，表明鍋內空氣已排 凈。 5升壓 當鍋內空氣排凈時，即可關閉排氣閥，壓力開始 上升。,6保壓 當壓力表指針達到所需壓力刻度時，控制熱源。 開始計時并維持壓力至所需時間。本實驗用121， 20min滅菌。 7降壓 達到所需滅菌時間后，關閉熱源，讓壓力自然下 降到零后，打開排氣閥。放凈余下的蒸汽后，再打開鍋 蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內剩水。 8無菌檢查 將已滅菌培養(yǎng)基于37培養(yǎng)24h，無雜菌生 長，即可待用。,注意事項：使用滅菌鍋應嚴格按照操作程序進行，避免發(fā)生事故；滅菌時，操作者切勿擅自離開，務必待壓力下降到零后，才可打開鍋蓋。,（3）間歇滅菌法：待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天 蒸煮1次，每次煮沸1h，連續(xù)3d 重復進行。在每兩次蒸 煮之間，將物品（指培養(yǎng)基）放在37C恒溫條件下培養(yǎng) 過夜，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成 營養(yǎng)體，以便下次蒸煮時殺滅。 （4）巴氏滅菌法：有些食物會因高溫破壞