1、微生物的培養(yǎng)和利用,第二節(jié) 大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗,思考？ 1.培養(yǎng)大腸桿菌需要配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中應(yīng)該添加哪些營養(yǎng)成分？培養(yǎng)基如何滅菌？ 2.若大腸桿菌和其他微生物混雜在一起，如何獲得大腸桿菌純種？獲得純種后如何保存？ 3.如何處理大腸桿菌便于在顯微鏡下觀察？,實驗主要原理,1.培養(yǎng)大腸桿菌的原理： 大腸桿菌的代謝類型為異養(yǎng)、兼性厭氧型，培養(yǎng)基中應(yīng)加入有機碳源、氮源、水和無機鹽。培養(yǎng)時應(yīng)提供有氧環(huán)境。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方： 牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，（20g瓊脂）加水定容至1000mL,2.平板劃線法分離大腸桿菌的原理,用接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線，將聚集的菌種逐漸稀釋

2、分散到培養(yǎng)基的表面。經(jīng)多次劃線后，可以分離由一個細(xì)胞繁殖而來的單菌落,此法可將細(xì)菌分為兩大類： 不被脫色而保持藍(lán)紫色者為 革蘭氏陽性菌（G+）； 被脫色后又被染上紅色者為 革蘭氏陰性菌（G-）。,大腸桿菌(革蘭氏陰性菌),金黃葡萄球菌(革蘭氏陽性菌),細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，再經(jīng)碘液媒染（以增加染料與細(xì)胞的親和力）后，用酒精或丙酮脫色，再用番紅復(fù)染。,3.革蘭氏染色，使大腸桿菌便于觀察的原理,實驗?zāi)康?1.配制牛肉膏蛋白胨固體、液體培養(yǎng)基，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌 2.掌握倒平板技術(shù)。 3.利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行大腸桿菌的擴增。4.用平板劃線法在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行接種 5.培養(yǎng)微生物并觀察大腸桿菌的單菌

3、落 6.顯微鏡下觀察大腸桿菌的形態(tài) 7.利用斜面培養(yǎng)基和劃線獲得的單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。,斜面大腸桿菌菌種,實驗流程,LB液體,LB固體50ml,培養(yǎng)基配 制和滅菌,用于大腸桿菌擴增,擴大培養(yǎng)（代替斜面菌種）,倒平板，大腸桿菌劃線培養(yǎng),獲得單菌落（純種分離）,100mL,5mL,挑取單菌落或液體培養(yǎng)基，制片，顯微鏡下觀察大腸桿菌,1.培養(yǎng)基的配制和滅菌,稱量,溶化,稱量溶化調(diào)pH 分裝高壓蒸汽滅菌擱斜面,分裝,加棉塞,包扎,高壓蒸汽滅菌,擱置斜面,2.無菌操作倒平板,3.平板劃線法接種,4.37恒溫箱中倒置培養(yǎng)1224h,倒置培養(yǎng)的原因： 培養(yǎng)基中的水分會以水蒸氣的形式蒸發(fā)，并凝結(jié)成水滴留在培養(yǎng)皿

4、的蓋上；水蒸氣形成的水滴會落入培養(yǎng)基表面并且擴散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則菌落中的菌會隨水?dāng)U散，菌落間相互影響，很難再分成單菌落，達(dá)不到分離的目的。,5.利用液體培養(yǎng)基擴大 培養(yǎng)大腸桿菌,搖床上震蕩培養(yǎng) 目的：,6.顯微鏡下觀察染色后 的大腸桿菌,增加溶氧 使菌體和培養(yǎng)液充分接觸,實驗結(jié)果觀察和分析,1.觀察平板劃線法獲得的單菌落,請分析沒有出現(xiàn)單菌落的可能原因？,菌液濃度大 劃線次數(shù)少 培養(yǎng)時間長,2.觀察液體培養(yǎng)基的渾濁度,空白培養(yǎng)基,生長細(xì)菌的培養(yǎng)基,3.顯微鏡下觀察經(jīng)革蘭氏染色的大腸桿菌,1.平板劃線法,分離微生物純種的方法,2.液體稀釋涂布法,1.實驗結(jié)束后，用過的細(xì)菌培養(yǎng)基等如何處理？,思考與討論,加熱滅菌后廢棄，不能直接傾倒到無機環(huán)境中，防止 細(xì)菌 污染,2.如何保存菌種？,在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再劃線接種在 空白 斜面上，37培養(yǎng)24h后，4冰箱保存。,3.未接種的培養(yǎng)