1、流式細胞儀檢測外周血樹突狀細胞分析CD123+（抗IL-3受體a鏈）和CD11c+樹突狀細胞亞群概述樹突狀細胞（DC）的主要功能是吸收抗原，進行加工，并向T淋巴細胞呈遞。其它抗原呈遞細胞也有此功能，如B淋巴細胞和單核細胞。但是，與其它細胞不同的是，DC細胞具有誘導初發(fā)免疫反應的獨特功能，例如，可以活化處女T細胞（Naive T cell）。DC細胞存在于外周淋巴組織中，已在血液和非淋巴器官中發(fā)現了不同類型的DC細胞，并被認為是淋巴組織中細胞的前體。由于血液和組織中DC細胞含量少，且缺乏特異的DC標記物，所以DC細胞的研究非常困難。因此，關于DC細胞的了解主要來自于通過密度梯度離心、培養(yǎng)、和/或

2、陰性選擇富集后的DC細胞的研究。這些過程利用了DC細胞的密度和黏附特征，和在一定細胞因子條件下的選擇性生長，或缺乏淋巴細胞、單核細胞和粒細胞的系列標記物的表達。但是，這些方法中DC細胞的產率和純度較低，且費時費力。而且，這些操作可以影響細胞的功能，并且無法做DC細胞含量的定量分析。最近的報告發(fā)現在活化DC細胞和血液或淋巴細胞分離培養(yǎng)的DC細胞表面CD83和CMRF-44高表達。CD83和CMRF-44可以作為DC細胞的活化標志物，但在體內或未處理的細胞上沒有特征性表達，或表達水平很低。在對新鮮分離的DC細胞的研究中，發(fā)現IL-3Ra在淋巴器官的DC細胞上有特異表達。從人類外周淋巴組織中分離的單

3、個核細胞中主要是此類DC細胞。IL-3Ra（CD123）抗體可以用來進行免疫磁珠分選，從外周淋巴組織制備的單個核細胞樣本中，將CD123+ DC細胞進行200倍富集。CD123抗體還可以用來做免疫組化分析，特異識別濾泡外T細胞富集區(qū)的CD123+ DC。在外周血中也有CD123+ DC細胞，與以前所說的CD11c- DC細胞和CD33dimCD14-CD16- DC細胞是同一類細胞。由于缺乏DC特異性標記物，目前仍然不清楚DC是否是自成一系的一類細胞。DC細胞既可以由成熟的外周血單核細胞生成，也可以由未分離的CD34+干祖細胞經GM-CSF和TNF-a培養(yǎng)得到。使用CD123抗體，發(fā)現有一群C

4、D34+ DC樣幼稚細胞。這群細胞與CD34+干祖細胞的區(qū)別是可以發(fā)育成Langerhan細胞樣DC。因此，根據CD123強染，可以識別出一類人類DC細胞，它是不同組織間DC細胞的連接橋梁。在外周淋巴組織中還發(fā)現另一個DC亞群，與CD123+ DC不同的是，其表型為CD11c+HLA-DR+LINdim/-。與CD123+ DC相反，這群DC細胞位于生發(fā)中心。在血中也含有CD11c+HLA-DR+LINdim/- DC細胞，與CD33brightCD14dimCD16- DC細胞是同一類細胞。由此可見，DC系統(tǒng)由多種細胞類型構成，發(fā)育途徑不一。但是，目前對這些細胞的功能和可能的特殊性、在生理或

5、病理條件下如何受調控等方面仍缺乏了解。CD123+ DC和CD11c+ DC細胞具有不同的表型，在淋巴器官中的位置也不同，提示它們可能有不同的功能。近年來的研究主要集中在使用DC細胞進行抗腫瘤和抗感染治療方面。不同報道證實，這有可能抑制腫瘤生長。使用這些新的DC標記物建立起來的檢測系統(tǒng)，可以幫助對新鮮外周血新鮮中的兩類不同的DC細胞進行定量檢測，同時可以加以分離。實驗方法采用三色或四色流式細胞儀分析，檢測速度快，樣本用量少，可以用來輔助研究在病理和生理條件下，DC在免疫調控中作用。檢測原理和用具檢測原理：本實驗目的是從外周血中檢測兩種類型的DC細胞：CD123+ DC（Anti-IL-3Ra+

6、）和CD11c+ DC。CD11c和CD123并不是DC特異的標志物。兩類細胞均HLA-DR高表達，單核細胞、淋巴細胞和NK細胞的系列標記物弱表達。因此使用單一熒光標記的LIN cocktail（LIN1）抗體將DC細胞區(qū)分出來。LIN1抗體包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56。另外，本實驗還可以區(qū)分嗜堿粒細胞。嗜堿粒細胞的表型是：LIN1-CD123+HLA-DR-。使用HLA-DR可以區(qū)分嗜堿粒細胞和CD123+ DC細胞。細胞來源：樣本使用EDTA、ACD或肝素鈉抗凝全血，或分離的外周血單個核細胞（PBMC）。樣本采集后24小時內檢測。試劑：1. 檢測DC細胞用的

7、BDIS熒光標記的單克隆抗體。四色分析：LIN1 FITC：貨號340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56CD123 PE（Anti-IL-3Ra）：貨號340545Anti-HLA-DR PerCP：貨號347364CD11c APC：貨號340544Mouse IgG1 PE：貨號349043Mouse IgG2a APC：貨號340473三色分析：LIN1 FITC：貨號340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56CD123 PE（Anti-IL-3Ra）：貨號340545CD11c PE：貨號347637Anti-HLA-D

8、R PerCP：貨號347364Mouse IgG1 PE：貨號349043Mouse IgG2a PE：貨號3490532. FACS Lysing Solution（10X）：FACS溶血素，貨號349202，用去離子水1：10稀釋3. 洗液：PBS緩沖液4. 1X PBS配制的1%多聚甲醛設備用具：1. EDTA、ACD或肝素鈉真空采血管2. 1275mm FALCON試管3. 振蕩混勻器4. FACS流式細胞儀5. 離心機6. 微量加樣器全血樣本熒光抗體染色步驟：1. 按照下表在各管中加入適量抗體；FITCPEPerCPAPC4-Color 四色分析Tube 1Tube 2LIN1 2

9、0uLLIN1 20uLCD123 5u（全血） 10uL（PBMC）Mouse IgG1Anti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLCD11c 5uLMouse IgG2a3-Color 三色分析Tube 1Tube 2Tube 3Tube 4LIN1 20uLLIN1 20uLLIN1 20uLLIN1 20uLCD123 5uL（全血） 10uL（PBMC）Mouse IgG1CD11c 5uLMouse IgG2aAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uL2. 每管加入100uL全

10、血，振蕩混勻，室溫暗處反應15分鐘；3. 加入2mL FACS溶血劑，振蕩混勻，室溫暗處放置10分鐘；4. 300xg離心5分鐘，棄上清；5. 振蕩混勻，加入1mL洗液；6. 300xg離心5分鐘，棄上清；7. 振蕩混勻，加入300uL 1%多聚甲醛；8. 2-8C暗處保存，24小時內上機分析PBMC樣本熒光抗體染色步驟：1. 按照上表在各管中加入適量抗體；2. 每管加入50uL全血，振蕩混勻，暗處冰浴反應25分鐘；3. 輕輕混勻，加入1mL洗液；4. 300xg離心5分鐘，棄上清；5. 輕輕混勻，加入300uL 1%多聚甲醛；6. 2-8C暗處保存，24小時內上機分析數據獲?。?. 使用Ca

11、liBRITE微球，做FACSComp，調整PMT電壓和熒光補償，檢查儀器靈敏度；2. 上樣：使用CELLQuest軟件，獲取50,000個細胞，用FSC設閾值，排除碎片干擾；3. 使用CELLQuest軟件分析結果數據分析：1. 區(qū)分細胞和碎片：使用FSC/SSC點圖，畫R1，排除碎片和死細胞；2. 找到LIN1弱陽性和陰性群體：使用Anti-HLA-DR/LIN1點圖（G1=R1），畫R2，圈定LIN1弱陽性和陰性細胞；3. 區(qū)分外周血DC和嗜堿粒細胞：在四色分析中，管1區(qū)分DC細胞和嗜堿粒細胞，管2是同型對照。在三色分析中，管1和管3區(qū)分DC細胞和嗜堿粒細胞，管2和管4是同型對照。使用同

12、型對照區(qū)分非特異染色在Gate List中定義G3=R1 AND R2。使用Anti-HLA-DR/CD123點圖和Anti-HLA-DR/CD11c點圖（G3=R1 AND R2），圖中只顯示LIN1弱陽性和陰性細胞。畫R3，圈定嗜堿粒細胞（Anti-HLA-DR-/CD123+）；畫R4，圈定CD123+ DC細胞（Anti-HLA-DR+/CD123+）；畫R5，圈定CD11c+細胞（Anti-HLA-DR+/CD11c+）；4. 在Gate List中定義各門：G4（嗜堿粒細胞）=R1 AND R2 AND R3，G5（CD123+ DC）=R1 AND R2 AND R4，G6（CD11c+ DC）=R1 AND R2 AND R5，G7=R1 AND R2 AND（R3 OR R4 OR R5）；5. 確認細胞群的準確性：下圖顯示了四色分析全血樣本時的CD123+ DC、CD11c+ DC和嗜堿粒細胞各群的位置。6. 分析各群細胞的百分含量：點擊Anti-HLA-DR/LIN1（G1=R1）點圖，做統(tǒng)計，得到各群細胞所占比例 CD123+ DC%R1 AND R2 AND R4 CD11c+ DC%R1 AND R2 AND R5 嗜堿粒細胞%R1 AND R2 AND R3在三色分析時，由兩個點圖分別得