1、細菌分離培養(yǎng)及鑒定,細菌的分離培養(yǎng) 細菌的染色鏡檢 細菌的生化試驗,一、細菌分離培養(yǎng),1、需氧菌的分離鑒定,細菌分離培養(yǎng)一般采取“劃線法”，主要有分區(qū)劃線，十字交叉劃線等方法，具體方法可按照個人習慣選擇應用，目的是達到使被檢材料適當?shù)南♂?，以達到獲得獨立單在的菌落，防止形成菌苔，以致不宜鑒別其菌落性狀。,幾種常見的劃線方法,劃線步驟,操作方法： 1、左手持平皿，用左手的拇指、食指和中指將平皿蓋揭開呈20左右的角度； 2、右手持接種環(huán)，從混合培養(yǎng)物中沾取少許混合物涂布在培養(yǎng)基邊緣，然后將接種環(huán)多余的混合物在火焰中燒灼，待冷卻后，再與所涂混合物的地方輕觸，在空白區(qū)劃線，后再燒灼，冷卻后再在空白區(qū)劃

2、線，反復操作，直至混合物稀釋到足夠形成單菌落。,注意事項： A 劃線前先將接種環(huán)稍彎曲，使其和平皿內(nèi)瓊脂面平行，不致于劃破培養(yǎng)基。 B 劃線中盡量不要重復、往復劃線，以免形成菌苔。 C 劃線接種完畢，在平皿底部寫上菌名、日期和接種者等標記，然后倒扣培養(yǎng)。,2、厭氧分離培養(yǎng),1、接種方法與需氧菌分離接種方法相同，僅培養(yǎng)條件發(fā)生變化。 2、厭氧培養(yǎng)方法主要有：二氧化碳厭氧法、生物學方法、化學方法、物理學方法等。,二氧化碳厭氧法： * 簡單的二氧化碳培養(yǎng)法可在盛放有培養(yǎng)物的有蓋玻璃缸內(nèi)，燃點蠟燭，蓋上玻璃缸蓋，當火焰熄滅時，該缸內(nèi)空氣二氧化碳濃度大約增加了5%10%。 * 化學方法生成二氧化碳，碳酸

3、氫鈉與硫酸鈉或碳酸氫鈉與硫酸作用即可生成二氧化碳。 * 現(xiàn)在實驗室設備中，已有二氧化碳培養(yǎng)箱，只需把二氧化碳的濃度設置成所需濃度即可達到相應的厭氧環(huán)境。,生物學方法： * 原理：利用培養(yǎng)基中含有的植物或動物組織消耗氧氣的原理制成。植物或動物的組織具有呼吸作用，組織中的可氧化物質也可以消耗培養(yǎng)基中的氧氣。 * 植物組織包括馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷物等； * 動物組織包括新鮮無菌的小片組織或加熱殺菌的肌肉、心、腦等。 * 目前比較常用的有厭氣肉肝湯培養(yǎng)基、碎肉培養(yǎng)基等。,化學方法： * 原理：利用還原性比較強的物質將培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣吸收。 * 連二亞硫酸鈉、碳酸鈉和氧氣反應生成硫酸鈉、亞硫酸鈉

4、和二氧化碳，消耗環(huán)境中的氧氣； * 每100立方厘米空間用1g焦性沒食子酸及10ml 10%氫氧化鈉或氫氧化鉀，焦性沒食子酸在堿性溶液中吸收大量氧氣，生成焦性沒食橙。,物理學方法： * 原理：利用加熱、密封、抽氣等物理學方法，以驅除或隔絕環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣，使其形成厭氧環(huán)境，利于厭氧菌的生長。 * 常用的方法有厭氧罐法、真空干燥器法、高層瓊脂法、加熱密封法等。,3、純培養(yǎng)與移植,*培養(yǎng)皿接種到斜面、單菌落接種到增菌肉湯、穿刺培養(yǎng)。 培養(yǎng)皿接種到斜面：右手執(zhí)無菌接種棒，無菌條件下，左手打開平皿蓋，用接種環(huán)挑取單菌落，立即取瓊脂斜面小管，將管口火焰滅菌。右手小指夾住管塞拔出，將接種針深入到待接小

5、管中，從斜面底部開始劃曲線，從下至上直至斜面頂端為止。管口通過火焰滅菌后，蓋好管塞。最后標注菌名、時間和接種者，置適宜條件培養(yǎng)。 *單菌落移植到肉湯培養(yǎng)基中增菌：挑取單菌落過程如上所述，接種到肉湯小管內(nèi)，置于適宜條件培養(yǎng)。 *穿刺培養(yǎng)：半固體移植采用穿刺法接種，方法基本與純培養(yǎng)接種相同，差別在用接種針挑取單菌落，垂直刺入培養(yǎng)基內(nèi)。,注意事項： A 接種環(huán)（針）火焰燒灼滅菌后要稍冷卻后再挑取菌落； B 打開平皿，接種過程保持無菌狀態(tài)，盡量靠近酒精燈燃心； C 接種后，培養(yǎng)小管或平板要置于適宜條件，利于細菌生長； D 穿刺培養(yǎng)，接種針要直刺直出，不要反復戳刺； E 芽孢菌耐殺滅，培養(yǎng)芽孢菌的實驗室

6、最好單獨使用，否則要徹底滅菌。,二、細菌抹片的制備及染色,1、細菌染色原理,由于細菌細胞結構和化學成分不同，因此具有毛細管、滲透、吸附和吸收等物理作用及離子交換、酸堿親和等化學作用。 利用各種染料對細菌細胞產(chǎn)生的各種物理、化學作用，使其著色情況具有差異，便于鏡檢觀察。,2、細菌抹片的制備,A 玻片準備：用95%酒精浸泡或滴95%酒精23滴，用潔凈紗布擦拭，然后在酒精燈外焰上拖過幾次，若油漬比較頑固，可滴12滴冰醋酸，用紗布擦拭后，在酒精燈外焰上拖過幾次。處理過的載玻片應清晰透明，潔凈而無油漬，滴上水后能均勻展開，附著性好。,B 抹片： 液體材料：如液體培養(yǎng)物、血液、滲出液、乳汁等，可直接用滅菌

7、接種環(huán)沾取一環(huán)材料，在載玻片中央均勻涂布成適當大小的薄層。 非液體材料：如菌落、膿、糞便等，現(xiàn)用接種環(huán)取少量生理鹽水置于載玻片中央，然后在用滅菌接種環(huán)沾取少量材料，在液滴中混合，均勻涂布成適當大小的薄層。 組織臟器材料：可先用鑷子夾持中部，然后用滅菌剪刀剪去一小塊，用其新鮮切面在載玻片上壓印或涂抹成一薄層。,C 干燥：一般采取自然干燥法。 D 固定：火焰固定和化學固定 火焰固定：干燥好的抹片涂抹面向上，背面在酒精燈外焰上來回擺動幾次，略加熱，但不能太熱，不燙手為宜。 化學固定：血液、組織臟器的抹片做姬姆薩染色不用火焰固定用甲醇固定。將已干燥的抹片浸入甲醇中23min，自然揮發(fā)干燥。,3、細菌染

8、色方法,染色方法主要有革蘭染色法、美藍染色法、抗酸染色法、瑞氏染色法和姬姆薩染色法。 以下以革蘭染色法為例簡要介紹操作方法。,革蘭染色法： * 原理：機理仍不清楚，一般認為與細菌細胞壁的結構和化學成分有關。 革蘭陰性菌細胞壁含有較多的脂類，當以95%酒精脫色時，脂類被溶去，使細胞壁孔隙變大，盡管酒精處理能使肽聚糖孔隙變小，但因為肽聚糖含量較小，細胞壁收縮有限，故能讓結晶紫與碘形成的紫色染料復合物被酒精洗脫出細胞壁之外，而被后來紅色的復染劑染成紅色。 革蘭陽性菌細胞壁所含脂類少，肽聚糖多，酒精脫色時，細胞壁孔隙縮小到不易讓結晶紫與碘形成的紫色染料復合物洗出細胞壁外，而被染成紫色。,操作方法： 1

9、、在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸銨結晶紫溶液，12min后，水洗； 2、滴加革蘭氏碘溶液于抹片媒染，作用13min后，水洗； 3、滴加95%酒精于抹片上脫色，作用2030s，水洗； 4、滴加沙黃水溶液或石炭酸復紅溶液復染1min，水洗； 5、用吸水紙吸干或自然干燥，鏡檢； 6、結果，革蘭陽性菌呈藍紫色，革蘭陰性菌呈紅色。,注意事項,A 制作抹片固定時溫度不能過高，溫度過高會使細胞壁中蛋白變性，染色中染液的滲出會有影響； B 革蘭染色法中，酒精濃度不能過高，也不能過低。此外，酒精脫色時間不宜過長，不要超過30s； C 瑞氏染色法中，由于染料中有沉淀，所以要避免沉淀附著在抹片上影響鏡檢觀察； D 染色水洗，水盡量用蒸餾水，水的流速不要過大，防止將細菌洗脫。,三、細菌生化試驗,生理生化鑒定管的選擇原則并非越多越好,應選擇一組能鑒