1、本課題學(xué)習(xí)目標(biāo),體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過(guò)程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。 1、主要概念：凝膠色譜法 電泳法 緩沖溶液 它們?cè)谘t蛋白的提取中分別起到什么作用。 主要原理： 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 電泳法分離樣品的原理 緩沖溶液的組成和作用機(jī)理,3、課題重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法 4、課題難點(diǎn)： 樣品的處理 色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。,1.分離生物大分子的基本思路：,選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。,2.蛋白質(zhì)分離和提取的原理：,根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性

2、質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)。,一、血紅蛋白的提取和分離,（一） 凝膠色譜法（分配色譜法）,2.凝膠：,大多數(shù)凝膠是由多糖類(lèi)化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。,根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來(lái)進(jìn)行分離。,1.概念：,3.凝膠色譜法的原理,當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢; 相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。 依據(jù)的特性是：蛋白質(zhì)分子量的大小。,4.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理

3、和具體過(guò)程,凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過(guò)程的動(dòng)畫(huà)演示,（二）緩沖溶液,1.概念:,在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng) 酸或強(qiáng)堿的影響使原來(lái)溶液PH值基本保持不變的混 合溶液。,能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PH值的影響， 維持PH基本不變。,2.作用:,思考：說(shuō)出人體血液中緩沖對(duì)。,NaH2PO4/Na2HPO4,H2CO3/NaHCO3,通常由12 種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。,4.提問(wèn)：在本課題中使用的緩沖液是:_ ,利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證 血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科 學(xué)研究(活性),磷酸緩沖液,3.緩

4、沖溶液的配制:,其目的是:,（三） 電泳：,1.概念：,帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。,2.原理：,許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正 電或負(fù)電。 在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。 分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素,3.類(lèi)型:,瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。,在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng),瓊脂糖凝膠電泳示意圖,聚丙烯酰胺凝膠電泳,1、測(cè)定蛋白質(zhì)分子

5、量:常用十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳。 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。,N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）,丙烯酰胺和交聯(lián)劑 N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng),蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決 于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。,2.原理：,SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全

6、取決于分子的大小。,3. SDS作用機(jī)理:,用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法,使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，可以測(cè)定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場(chǎng)上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。,二、實(shí)驗(yàn)操作,樣品處理粗分離純化純度鑒定,1.樣品處理：,（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟,（二）操作過(guò)程,可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液來(lái)分離血紅蛋白。,2.提問(wèn)：血液有哪些成分？,1.提問(wèn)：用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用豬、牛、羊的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？,雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便

7、于進(jìn)行DNA的提取；人的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。,每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)， 此基團(tuán)可攜帶一分子O2或一分子CO2，血紅蛋白因含有血紅素而 呈紅色。,血紅蛋白的特點(diǎn)：,(1)紅細(xì)胞的洗滌:,去除雜質(zhì)蛋白，利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化.,1、采集血樣 2、低速短時(shí)間離心（速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì) 胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果） 3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。 4、鹽水洗滌：下層暗紅色的紅細(xì)胞+五倍體積的0.9 的NaCl溶液洗滌，攪拌10min 5、低速短時(shí)間離心： 6、重復(fù)3、4、5步驟三次 上清液中已沒(méi)有黃色：紅細(xì)胞洗滌干凈。,目的:,操作

8、：,洗滌次數(shù)過(guò)少,無(wú)法除去血漿蛋白。,(2)血紅蛋白的釋放：,加蒸餾水到原血液體積，,加40體積的甲苯 （溶解細(xì)胞膜）,置于磁力攪拌器攪拌10min（加速細(xì)胞破裂）,紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白,(3)分離血紅蛋白溶液：,過(guò)程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min。,試管中溶液層次： 第1層（最上層）：甲苯層（無(wú)色透明）； 第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）； 第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）； 第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。,分離： 濾紙過(guò)濾：除去脂溶性沉淀層， 分液漏斗中靜置：分出下層的紅色透明液體。,甲苯層（

9、無(wú)色透明）,白色薄層固體,紅色透明液體,雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）,試管中溶液層次,(4)透 析：,過(guò)程： 取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12h,目的： 除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)和離子。 或用于更換樣品的緩沖液。,透析過(guò)程動(dòng)畫(huà)演示,2.凝膠色譜操作:,（1）凝膠色譜柱的制作：,取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端磨平。 底塞的制作： 打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離

10、不徹底。 頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。 組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。 安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。,（2）凝膠色譜柱的裝填,凝膠的選擇： A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。 B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度 及分離范圍。 75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨 脹時(shí)吸水7.5克。 凝膠的前處理： 配置凝膠懸浮液： 計(jì)算并稱(chēng)取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中 充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。,凝膠色譜柱的裝填方法： A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。 B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱 內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻 注意： 1、裝填時(shí)盡量緊密：降低凝膠顆粒

11、之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。,洗滌平衡： 連接緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/L的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12h。 注意： 1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響分離效果 2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。,（2）凝膠色譜柱的裝填,50cm高,（3）樣品加入與洗脫,調(diào)節(jié)緩沖液面： 打開(kāi)下端出口，使緩沖液下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口 滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端， 注意： 1、不要觸及并破壞凝膠面。 2、貼壁加樣 3、吸管管口貼著管壁環(huán)繞

12、移動(dòng)加樣 樣品滲入凝膠床：打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)， 樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口 洗脫：加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度， 連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫。 收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出 液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。 （如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功）,（3）樣品加入與洗脫,注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。,思考下面的問(wèn)題：,讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能正常。,1、在血紅蛋白純化的整個(gè)過(guò)程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什

13、么？,2、與其他蛋白質(zhì)相比，血紅蛋白有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行血紅蛋白的分離有什么啟示？,血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。,血紅蛋白提取和分離的程序包括： 樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。 樣品的處理：通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、 離心等操作收集到血紅蛋白溶液， 樣品的粗分離:透析去除分子量較小的雜質(zhì) 樣品的純化：凝膠色譜法除去相對(duì)分子質(zhì)量較大 的雜質(zhì)蛋白 純度鑒定:聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。,3、你能描述血紅蛋白分離的完整過(guò)程嗎？,（三）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）,2.試劑的配制：,鑒定血紅蛋白純度。,1.目的：,3.方法步驟：（略）,觀察處理的血液樣品離心后是否分層，如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。 此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。,三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià),1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？,2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？,1、由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。 2、加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚