1、第一節(jié) 引言,蛋白質存在于一切生物體中，是非常重要的生物大分子。蛋白質是生物功能的執(zhí)行者，擔負著生物催化、物質運輸、運動、防御、調控及記憶、識別等多種生理功能。,第二章 蛋白質分離純化原理與技術,一、分離純化的意義,從生物材料中分離制備蛋白質，研究其結構與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生命現象的本質有重大意義。 工業(yè)生產的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。 醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。 基因工程的需要,二、分離純化的要求,1、純度：主要取決于研究的目的和應用上的要求。如作為研究蛋白和一級結構、空間結構，一級結

2、構與功能的關系的蛋白質制劑、工具酶和標準蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應用的酶和蛋白質制劑，達到一定純度即可，不要求均一。 2、活性：要求大分子保持天然構象狀態(tài)，有高度的生物活性。 3、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。,三、分離純化的一般程序,蛋白質分子的分離純化一般可分為以下幾個階段： 材料的選擇和預處理 破碎細胞及提取（有時還需要進行細胞器的分離） 分離純化：包括粗分級分離和細分級分離 其中前兩個階段為分離純化的前處理。,第二節(jié) 蛋白質分離純化的前處理,一、材料的選擇與預處理 選擇材料主要根據實驗目的而定。工業(yè)生產上注

3、意選擇含量高、來源豐富、易獲得、制備工藝簡單、成本低的動植物組織或微生物做原料?？蒲羞x材則無需考慮上述問題，只要能達到實驗目的即可。 實驗材料選定后，常常需要進行預處理，如動物材料需要除去一些與實驗無關的結締組織、脂肪組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開。另外，必須盡可能保持材料的新鮮，盡快加工處理。若不立即進行實驗或加工，應冷凍保存。,二、細胞的破碎,分離提取某一生物大分子，首先要求生物大分子從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟生物活性。因此應選擇適當的方法將組織和細胞破碎。但若材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進行組織細胞的

4、破碎。,組織細胞的破碎方法很多，不同的實驗規(guī)模，不同的實驗材料和實驗要求，使用的破碎方法和條件也不同。 一般動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。 植物組織和細胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質組成的細胞壁，一般常用與石英砂和適當的提取液一起研磨的方法破碎或用纖維素酶處理也能達到目的。 細菌細胞的破碎比較困難，因為整個細菌細胞壁的骨架實際上是一借共價鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎的方法常有超聲波震蕩、與石英砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。,三、細胞器的分離,細胞器包括細胞核、線粒體、核糖體、內質網，植物細胞還有葉綠體。 如果要分離制備分布在

5、這些細胞器中的生物大分子，為了防止其他細胞組分中的物質對制備物的干擾或污染，還需先將細胞器分離出來，然后在某一細胞器中分離某一物質。 細胞器的分離一般采用差速離心法，即將破碎后的細胞在適當的介質中進行離心，常用的介質有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細胞組分按質量大小的不同，經過不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經多次分步離心后，即可獲得所需組分。,四、提取,組織細胞破碎過程中，大量的胞內酶及細胞內含物被釋放出來，必須立即將其置于一定條件下和溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，避免因長久放置造成制備物的分解破壞，這就是提取。,1、蛋白質的提取,大多數蛋白質均能溶

6、于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中，故蛋白質的提取一般以水溶液提取為主。通常采用類似生理條件下的緩沖液，如20-50m mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.0-7.5）或0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0）緩沖液作提取液。 對于一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性較多的蛋白質，不溶于水、稀鹽、稀堿、稀酸，常在提取液中加入適量的有機溶劑，如乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。,第三節(jié) 蛋白質分離純化,從細胞中提取得到的蛋白質往往是不純的，含有大量雜質，必須進一步分離純化，這一階段可分為粗分級分離和細分級分離兩步進行。,一、蛋白質的分離純化,蛋白質分離純化的方法很多，主要是根據蛋白分子之間特

7、異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。 性質 方法 分子大小 透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾 溶解度 等電點沉淀、鹽析、有機溶劑沉淀 電荷 電泳、離子交換層析 吸附性質 吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析） 對配體分子 親和層析 的生物親和力,主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點是簡便、處理量大、既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白質，但分辨率低。,1、粗分級分離,（1）鹽析,向蛋白質溶液中加入大量的中性鹽（NH4)2SO4，Na2SO4，使蛋白質脫去水化層而聚集沉淀，這種現象稱為鹽析。 鹽析作用是由于當鹽濃度較高時

8、，鹽離子與水分子作用，使水的活度降低，原來溶液中大部分的自由水轉變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質極性基團與水分子之間的作用，破壞蛋白質分子表面的水化層，使蛋白聚集沉淀。同時鹽離子可以中和蛋白質的表面電荷，也促進蛋白的沉淀。,不同的蛋白質分子，由于其分子表面的極性基團的種類、數目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調節(jié)蛋白質的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質分別沉淀。如：,血清,球蛋白,清蛋白,(NH4)2SO4,50%飽和度,100%飽和,析出,析出,分段鹽析,（2）等電點沉淀,蛋白質是兩性電解質，其溶解度與其凈電荷數量有關，隨溶液pH變化而變化。在溶液pH值等于

9、蛋白質等電點時，蛋白質的溶解度最小。 不同的蛋白質有不同的等電點，因此通過調節(jié)溶液pH到目的蛋白的等電點，可使之沉淀而與其它蛋白質分開，從而除去大量雜蛋白。,（3）有機溶劑法,與水互溶的極性有機溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白質在水中的溶解度顯著降低。 有機溶劑引起蛋白質變性的原因有兩個： 降低水的介電常數，使蛋白質分子表面可解離基團的離子化程度減弱，水化程度降低，促進了蛋白質分子的聚集沉淀。 是極性有機溶劑與蛋白質爭奪水化水，而使蛋白質分子沉淀。,室溫下，這些有機溶劑不僅能使蛋白質沉淀，而且伴隨著變性。若預先將有機溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下將其逐漸加入蛋白質溶液中，防止有機溶劑局部濃度過高，

10、則在很大程度上解決變性問題。 不同的蛋白質由于水化層厚度不同，發(fā)生沉淀需要的有機溶劑濃度不同，因此可利用不同濃度的有機溶劑分離不同的蛋白質。,2、細分級分離,一般蛋白質樣品經粗制分級后，體積較小，雜質大部分被除去。進一步提純，通常使用高分辨率的柱層析及電泳方法。 常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析。 常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。 另外，結晶也是蛋白質分離純化的方法之一，制備的結晶物常常作為蛋白質結構分析之用。,酶的活力測定,在酶的制備過程中，每一步驟都應測定留用以及準備棄去部分中所含酶的總活力和比活力，以了解經過某一步驟后酶的回收率、純化倍

11、數，從而決定這一步的取舍。 總活力=活力單位/ml酶液總體積（ml） 比活力=總活力單位數/總蛋白（氮）mg 純化倍數=每次比活力/第一次比活力 回收率（產率）=（每次總活力/第一次總活力）100%,第四節(jié) 蛋白質純度鑒定,生物大分子經過分離提純，最后還要鑒定制品的純度。 蛋白質和酶制品純度鑒定通常采用的方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、超速離心沉降分析法、免疫化學法、N-末端氨基酸分析法等。 純的蛋白質在一定條件下進行電泳，將以單一的速度移動，它的電泳圖譜只出現一條帶。同樣純的蛋白質在離心場中，應以單一的沉降速度移動。 選用任何單獨一種鑒定方法都不能最后確定蛋白質的純度，

12、必須同時采用2-3種不同的方法才能確定。,第五節(jié) 蛋白質的層析分離,應用廣泛。特征：有一個固定相和一個流動相。由于待分離的各種物質在這兩個相分配系數不同，當兩個相作相對運動時，這些物質在兩相間反復多次分配，結果使其相互分開。 根據兩相的狀態(tài)，層析法可分為：氣相層析和液相層析；按層析原理可分為：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析等。按操作形式分為：柱層析、薄層層析、紙層析等。,分配系數: k=Cs/Cm ,物質在固定相與流動相濃度之比。質量分配系數：D=kVs / Vm , Vs , Vm 為固定相和流動相的體積。,一、層析的一般原理,如果柱頂加入32mg樣品，樣品的質量分

13、配系數D為1，即樣品在兩相中是等量分配。經過5層的平衡分配后，樣品在柱的分配情況見圖。樣品集中在中間。如果D1，樣品集中在中間偏下。,離子交換層析(IEX)是根據電荷來分離分子的。 離子交換劑是通過化學反應將解離基團引入到惰性支持物上形成的。分為： 陽離子交換劑: 解離基團帶負電, 結合陽離子; 陰離子交換劑: 解離基團帶正電, 結合陰離。 蛋白質分子是兩性物質。當pHpI，分子帶負電，可結合陰離子交換劑；當pHpI，分子帶正電，可結合陽離子交換劑。如陽離子交換劑與帶正電蛋白質分子之間有如下平衡：,二、離子交換層析,（一）基本原理,帶電蛋白質分子與交換劑的結合是可逆的。 由于pH可改變蛋白質的

14、帶電性質和帶電量，鹽離子會影響蛋白質在交換劑上吸附。所以用一定濃度的鹽溶液或一定pH 的緩沖液就可把蛋白質從離子交換劑上洗脫下來。對多組分混合物，每種分子所帶的電荷不同，因此，可用不同的離子強度 或不同的pH溶液將蛋白質從交換劑上一一洗脫下來。,（二）離子交換劑的基本類型,根據可供交換的離子的性質，離子交換劑可被分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。若按酸堿性的強弱，又可分為強酸、強堿、弱酸、弱堿幾種類型的離子交換劑。 強酸和強堿型交換劑能在較廣泛的pH范圍內（pH212）完全解離。弱酸型交換劑在低于pH4、弱堿型交換劑在高于pH9就難于解離，因而失去交換能力。因為一般蛋白質在pH68之間穩(wěn)定，所以

15、常用弱酸或弱堿型交換劑。,離子交換基團的結構和性質,可用來作為交換劑支持物的物質種類較多。早期用于分離氨基酸、小肽和其它小分子物質的離子交換樹脂的支持物是聚苯乙烯類。 分離蛋白質的常用的親水性支持物。有三大類：纖維素、葡聚糖凝膠(sephadex)、瓊脂糖凝膠(sepharose)和合成凝膠(Trisacryl和Fractogel)。,1、離子交換纖維素 離子交換纖維素是以纖維素做支持介質的。具有松散的親水性網絡，較大的表面積，吸附容量大，通透性好。根據離子交換纖維素所含離子交換基團的性質可分為強酸、強堿型和弱酸、弱堿型?，F將常用的離子交換纖維素列于下表中。,常用的離子交換纖維素,離子類型,解

16、 離 基 團,特 點,DEAE-,OCH2CH2N+(C2H5) ,在 pH8.6 應用,常用的離子交換纖維素,在Sephadex上接上某種離子交換基團。這種凝膠既有離子交換劑的性質，又有分子篩效應。因此，其分離能力比單純的層析凝膠或離子交換劑好。葡聚糖凝膠離子交換劑的交換量比相應的纖維素離子交換劑大，如DEAESephadex的交換量大約是DEAE纖維素的3.55.0倍。,2、離子交換葡聚糖凝膠（Sephadex）,葡聚糖凝膠離子交換劑的性質,-O-C2H4N+(C2H5)2,將各種離子基團引入到交聯(lián)瓊脂糖(Speharose CL)和大孔合成凝膠(Trisacryl或Fractogel)上

17、，則形成一系列離子交換劑。這類交換劑即堅硬、吸附容量大，形狀球形，能維持較好的流速及分辨率。,3、交聯(lián)凝膠離子交換劑,（三）層析條件的選擇,1、離子交換劑的選擇 選擇離子交換劑之前要了解樣品的性質：熱穩(wěn)定性、帶電情況、pH和鹽濃度對其活性和溶解度的影響。一般情況下，帶負電的物質用陰離子交換劑，反之，則用陽離子交換劑。實驗室中最廣泛使用的是DEAE和CM 交換劑。,2、交換顆粒大小的選擇 粒子大小主要影響分辨率和流速。粗粒子：交換容量小、間隙大、分辨率底、流速較快。細粒子：分辨力高、交換容量大但是流速慢。,3、層析緩沖液的選擇 選擇正確的緩沖液可獲得較好的層析效果。因為離子相互作用取決于pH，而

18、維持介質的pH，通常是由緩沖液來實現的。所用緩沖液的種類、pH大小，決定 待分離組分的穩(wěn)定性和溶解度。,為避免緩沖液的離子參與離子交換過程，采用緩沖液所帶的電荷應與離子交換劑所帶電荷相同。使用陽離子交換劑時，要用陰離子型緩沖液（磷酸、醋酸等）；使用陰離子交換劑時要用陽離子型緩沖液（Tris、胺鹽、吡啶等）。,要得到好的分離效果，層析時要注意層析柱的高度和體積；上樣量的大??；洗脫液體積；洗脫速度；分級物的收集量。 1、柱床體積：至少要比結合所有樣品所需要的要大25倍。離子交換層析所用的柱不用太長，以便縮短操作時間。 2、樣品pH 和離子強度：與起始緩沖液具有相同的pH和離子強度。 3、洗脫液體積

19、和洗脫梯度的形狀：對柱的分辨率影響很大。洗脫可用恒定組成的緩沖液來完成（簡單洗脫）也可用改變pH或鹽濃度，或二者均改變的洗脫液來完成。pH和鹽濃度的改變又分為連續(xù)改變（梯度洗脫）和不連續(xù)改變（階段洗脫） 。,（四）柱層析技術,交換劑的處理就是將交換劑轉變?yōu)檫m合分離目的的離子類型。一般包括除雜質、溶脹，除細粒和改型。改型就是用適當的離子平衡，使交換劑帶上希望的離子。陽離子和陰離子交換劑最后分別為Na和Cl型是最穩(wěn)定形式。,4、洗脫速度：太快或太慢都會降低柱的分辨率。 5、分級物收集量：關系到能否充分代表層析柱的分辨率。一般總洗脫體積在5002000ml時，每管收集510ml,（五）離子交換劑的處

20、理和再生,離子交換劑價格較貴，用后再經過再生處理，可反復多次使用。處理時避免用強酸或強堿長時間浸泡，以防載體的糖鏈結構遭水解破壞。,各類離子交換劑的再生條件,血清蛋白常用離子交換層析分離。IgG可用QAESephadex A50或DEAESephadex A50分離?，F在臨床上有重要用途的許多血清蛋白，如白蛋白，factor IX復合物和專一性免疫球蛋白已用離子交換層析大規(guī)模生產。,（六）離子交換層系的應用實例,凝膠層析又稱凝膠滲透層析、排阻層析，分子篩層析等。它主要用于分離分子大小不同的生物大分子及測定其分子量。凝膠層析設備簡單，操作簡便，每次層析后無需再生處理，因此，在生化研究中應用及其廣泛。,三