1、免疫化學(xué)診斷技術(shù)的進展,Automated Chemiluminescence System,利用抗原抗體反應(yīng)和分離技術(shù)測定(量)與疾病有關(guān)的化學(xué)分子。,免疫化學(xué)診斷技術(shù),免疫同位素標(biāo)記測定法 化學(xué)發(fā)光法 酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光 偏振熒光 時間分辨熒光 電化學(xué)發(fā)光 直接化學(xué)發(fā)光,免疫化學(xué)診斷技術(shù)的分類,免疫同位素標(biāo)記測定法,放射免疫法已有30多年歷史。比較其它傳統(tǒng)的方法，它有特異性好，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，可靠性強等特點，故在臨床科研上廣泛使用。,免疫同位素標(biāo)記法之局限,半衰期短 ； 試劑批內(nèi)與批間差異大； 反應(yīng)過程長； 靈敏度有限； 放射性廢物的處理；,免疫化學(xué)發(fā)光法,酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光 偏振熒光 時間分辨熒

2、光 電化學(xué)發(fā)光 直接化學(xué)發(fā)光,免疫化學(xué)發(fā)光法簡介 - 酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光 (EMCLIA),原理： 抗體包被的塑料固相 加入待測樣本 - 抗原 加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體 洗 加入底物 - 4-Mup, 發(fā)光 產(chǎn)品： 雅培Axsym, 梅里埃Vidas, 強生Vitros, DPC Immulite 2000, 羅氏ES300,原理： 標(biāo)記在小分子抗原上的熒光素經(jīng)485nm的激發(fā)偏振光照射後，發(fā)出光子，經(jīng)過偏振儀形成525550nm的偏振光； 這一偏振光的強度與熒光素受激發(fā)時分子轉(zhuǎn)動的速度呈反比，游離的熒光素標(biāo)記抗原，分子小，轉(zhuǎn)動速度快，激發(fā)後發(fā)射的光子散向四面八方，因此偏振光信號弱； 在測定過程中待

3、測抗原小分子，熒光標(biāo)記抗原小分子和特導(dǎo)性沆體大分子同時加入到一反應(yīng)杯中，待測抗原越少，與抗體競爭結(jié)合的量越少，而熒光標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合就越多，而熒光標(biāo)記的小分子抗原與大分子抗體結(jié)合後，其分子的轉(zhuǎn)動速度減慢，由此熒光偏振信號強。 產(chǎn)品：雅培Axsym,免疫化學(xué)發(fā)光法簡介 - 偏振熒光 (FPIA),原理： 標(biāo)記物為三價稀土離子如：銪 (Eu3+)、釤(Sm3+)、鏑(Dy3+)和鋱(Tb3+)等，它們可利用具有雙功能基團結(jié)構(gòu)的螫合劑，在水溶液中與抗原分子以共軛雙鍵結(jié)合，形成稀土離子螫合劑抗原結(jié)合物。 當(dāng)標(biāo)記稀土離子的抗原與待測抗原共同與抗體競爭結(jié)合，形成抗原抗體免疫復(fù)合物，其中含有標(biāo)記稀土離子，

4、然後利用時間分辨熒光分析儀，可測出復(fù)合物中稀土離子發(fā)射熒光的強度，以此確定待測抗原的含量。 產(chǎn)品： EG&G的DELFIA,免疫化學(xué)發(fā)光法簡介 - 時間分辨熒光 (TRFIA),原理： 先將特異性抗體包被在磁性微珠。另外將發(fā)光劑Ru (bpy)32+標(biāo)記在特異性抗體上。 將待測樣本與包被抗體的磁性微珠和發(fā)光劑標(biāo)記的抗體共同溫育，形成磁性微珠包被抗體抗原發(fā)光劑標(biāo)記杭體復(fù)合物。 加入TPA緩沖液和TPA在電極表面進行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光。 產(chǎn)品： 羅氏Elecsys,免疫化學(xué)發(fā)光法簡介 - 電化學(xué)發(fā)光 (ECLIA),免疫化學(xué)發(fā)光法簡介 - 直接化學(xué)發(fā)光 (CLIA),原理：利用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和

5、磁性微粒子分離技術(shù)相結(jié)合的測定方法。以丫啶酯為發(fā)光的標(biāo)記物，固相載體為極細小的磁性顆粒。其測定原理與放射免疫和聯(lián)免中的雙抗體夾心法和競爭結(jié)合法相似。 單克隆抗體或抗原包被磁性微粒 抗原抗體結(jié)合，洗滌分離 加入氧化劑發(fā)光：經(jīng)過加入氧化劑（H2O2）和 pH 糾正液（NaOH）使成鹼性，這時丫啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光，集光器和光電倍增管接收。記錄5秒鐘內(nèi)所產(chǎn)生的光子能。 產(chǎn)品： 拜耳ACS:180SE, Advia Centaur, Advia IMS,全 自 動 化 學(xué) 發(fā) 光 系 統(tǒng) 拜耳 ACS (Automated Chemiluminescence System),免疫化學(xué)發(fā)

6、光法簡介 - 直接化學(xué)發(fā)光 (CLIA),直接化學(xué)發(fā)光的機理 - ACRIDINE ESTER丫啶酯,最 簡 易 最 快 速,非常穩(wěn)定； 與抗體或抗原結(jié)合不影響發(fā)光；,N,+,CH,3,Br,C,O,O,CH,3,CH,3,R,丫啶酯 ：在pH10時，快速充分釋放光子。,丫啶酯 - ACRIDINE ESTER,不需催化劑 穩(wěn)定性高 產(chǎn)光強 線性好 本底低 反應(yīng)快 結(jié)合后不影響發(fā)光 靈敏度高 - 可達10-15 摩爾,直接化學(xué)發(fā)光的機理,丫,丫,啶,啶,酯,酯,一,一,秒,鐘,直,直,接,接,閃,閃,光,光,，,，,強,強,度,度,是,是,碘,碘,125,125,在,在,一,一,分,分,鐘,鐘

7、,發(fā),發(fā),出,出,光,光,子,子,的,的,十,十,萬,萬,倍,倍,0,6.0,5.0,2.0,1.0,0,200,000,400,000,600,000,800,000,1,000,000,3.0,4.0,秒,100,200,300,400,500,600,直,接,閃,光,慢,發(fā),光,光,強,度,直接化學(xué)發(fā)光的機理,直接化學(xué)發(fā)光的機理,由,于,超,低,本,底,直,接,化,學(xué),發(fā),光,具,有,高,靈 敏,性,Tracer Concentration (moles/L),sensitivity limit,of fluorescence,sensitivity limit of,chemilumi

8、nescence,Fluorescence,Background Noise Level,10,10,9,9,8,8,7,7,6,6,5,5,4,4,3,3,2,2,1,1,0,0,10,10,-15.5,10,10,-17,10,10,-16,10,10,-15,10,10,-14,10,10,-13,10,10,-12,10,10,-10,10,10,-9,10,10,-8,10,10,-11,tracer signal,直接化學(xué)發(fā)光的機理,直,直,接,接,化,化,學(xué),學(xué),發(fā),發(fā),光,光,不,不,受,受,pH,pH,和,和,溫,溫,度,度,影,影,響,響,n,n,減輕漂移,減輕漂移,n,n

9、,提高重復(fù)性,提高重復(fù)性,0,0,20,20,40,40,60,60,80,80,100,100,120,120,8,8,9,9,10,10,1,1,1,1,12,12,13,13,pH,pH,pH,pH,Temperature Degrees C,Temperature Degrees C,120,120,100,100,80,80,60,60,40,40,20,20,0,0,15,15,20,20,25,25,30,30,35,35,40,40,直,接,閃,光,慢,慢,發(fā),發(fā),光,光,直,直,接,接,閃,閃,光,光,慢,慢,發(fā),發(fā),光,光,Relative,Relative,LIght,L

10、Ight,Intensity (%),Intensity (%),溫,溫,度,度,Relative,Light,Intensity,直接化學(xué)發(fā)光與電化學(xué)發(fā)光比較,丫啶,酯直接發(fā)光,CL(AE),電,化,學(xué),發(fā),光,ECL(TU + TPA),信,號,的,產(chǎn),生,丫啶,酯,與,H,2,O,2,的,簡,單,反,應(yīng),需,三,個,電,板,去,激,發(fā),由,幾,個,分,子,態(tài),參,加,的,復(fù),雜,反,應(yīng),速,度,不,到,2,秒,5,秒，,但,洗,電,極,需,40- 60,秒,靈,敏,度,10-,15,M,，足,以,滿,足,免疫,試,驗,的,要,求,10,-11,-,10-,17,M,本,底,極,低,較,高

11、，過,剩,的,TPA,會,發(fā),光,特,異,性,不,受,溫,度,與,pH,的,影響,受,pH,金,屬,及,螯,合,物,影,響,微顆粒,粗顆粒,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,功能 抗原抗體反應(yīng)相 結(jié)合與未結(jié)合的分離 特點 縮 短 擴 散 距 離 提 高 捕 獲 效 率 表 面 面 積 為 包 覆 的 試 管 和 玻 璃 珠 之 50倍 有 利 于 結(jié) 合 動 力 學(xué) 提 供 更 高 之 靈 敏 度,微磁顆粒技術(shù),扁平的設(shè)計,結(jié)合相,磁場,狄窄空間以利快速抽吸,吸液探針,以 便 最 怏 速 , 最 干 凈 地 分離 結(jié) 合 物 與 未 結(jié) 合 物 以 便 獲 得 高 靈 敏 度 及

12、 高 重 復(fù) 性,試 杯 的 最 佳 設(shè) 計 - 配 合 微 磁 粒 體 技 術(shù),降 低 人 抗 鼠 抗 體 (HAMA) 的 干 擾為 大 分 子 的 測 定 提 供 了 高 靈 敏 度 和 高 特 異 性,單 抗,多 抗,直 接 發(fā) 光,FSH,反應(yīng)過程的結(jié)構(gòu)設(shè)計 - 單 - 多 抗 體標(biāo)記法,是 一 種 確 保 高 靈 敏 度 同 時 又 廣 譜 的 設(shè) 計,B G G,B G G,直 接 發(fā) 光,反應(yīng)過程的結(jié)構(gòu)設(shè)計 - 抗體 一 步 標(biāo) 記 法,磁顆粒,ACS:180 SE 之 特 性,隨 機 存 取 直 接 化 學(xué) 發(fā) 光 臺 型 設(shè) 計 180 測 試 /小 時 十 五 分 鐘 內(nèi)

13、 首 次 結(jié) 果 自 動 重 復(fù) 功 能 自 動 機 內(nèi) 稀 釋 凝 塊 識別 兼 容 原 樣 品 試 管 條 碼 識 別 60 個 樣 品 容 量,緊 急 樣 品 容 納 機 上 容 納 十 三 種 項 目 試 劑 清 單 微 量 固 相 廢 物 質(zhì) 控 報 告 儲 存 機上儲存質(zhì)詢，電影演示 一小時離機 雙 向 界 面 宿 主 詢 問 廣 譜 試 驗 項目系列 實 驗 室 自 動 化 匹 配,臨 床 應(yīng) 用 項目 按 疾 病 分 類,甲 狀 腺 功 能 T4, T3, TUp, FT4, FT3, TSH, TSH-3 生 殖 系 統(tǒng) ThCG, LH2, FSH, Estradiol,

14、Estradiol6-II, Progesterone, Prolactin, Testosterone 內(nèi) 分 泌 Cortisol (serum+urine) 貧 血 B12, Ferritin, Folate, RBC Folate 心 血 管 CK-MB, Myoglobin, Troponin I,腫 瘤 標(biāo) 記 CEA, AFP, PSA2, fPSA, CA15-3 , CA125, CA19-9 藥 濃 度 監(jiān) 測 Digoxin, Theophylline, Phenobarbital, Phenytoin, Vancomycin, Gentamicin, Digitoxin

15、, Carbamazepine 骨 代 謝 Deoxypyridinoline 過 敏 Total IgE,發(fā) 展 中 新 項 目,Insulin, C-peptide, anti-insulin DHEA-Sulfate SHBG Tobramycin, Quinidine Homocysteine beta-2 microglobulin E3 Anti-TPO Anti-TG Equimolar PSA Complex PSA HER-2/neu,免疫化學(xué)定量分析之進化,2.5 hours 0.12 U/mL,79年 IRMA,50 minutes .03 U/mL,88年 半自動 Ma

16、gic,7.5 minutes .03 U/mL,91年 ACS:180,2 days 1.0 U/mL,70年代中 商業(yè)化 RIA,5 days 1.0 U/mL,60年代初 研究 RIA,以 TSH 甲狀腺刺激素試驗為例,免疫化學(xué)方法靈敏度之提高,10-16 M,10-11 M,10-12 M,免疫熒光,免疫媒標(biāo),放射免疫,直接化學(xué)發(fā)光,10-11 -10-17 M,免疫傳感技術(shù) 免疫PCR技術(shù),? M,電化學(xué)發(fā)光,免疫熒光偏振,ACS:180 系 列 發(fā) 展 史,1974 - 首創(chuàng)微玻璃珠放免法 1978 - 首次FT4 放免法 1979 - 首次 TSH 放免法 1982 - 首次維生

17、素12/葉酸固相法 1983 - MAGIC 上市 1986 - 首次直接化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 - MAGIC LITE 1991 - 首次全直動隨機存取之化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 - ACS 1992 - 首次全直動維生素12/葉酸測定 1993 - 延長操作附件 1994 - 首次凝塊探測功能 1994 - ACS通過ISO9001標(biāo)準(zhǔn),心血管系統(tǒng),如何能,更快,更準(zhǔn)確,更全面的,診斷AMI,時心電圖并不能典型歸類,診斷急性心肌梗塞之困難,一半有不穩(wěn)定胸口窒息痛的病人，入 院,病人重發(fā)梗塞診斷困難,引致不能及時診斷AMI,延遲適當(dāng)?shù)闹委?、護理,臨床需要,盡早分辨、準(zhǔn)確診斷AMI方法,肌肉組織,心肌

18、,心肌細胞特異性標(biāo)志,肌鈣蛋白,I,C,T,肌鈣蛋白 I,釋放入血,c,心肌壞死,（氨基酸順序40差異）,心肌細胞,肌紅蛋白,肌酐激霉MB,心肌壞死,釋放入血,（含量大）,血液濃度 明顯升高,(CK-MB),6 5 4 3 2 1,0 4 8 12 16 20 24 48 72 96 h,肌紅蛋白,CK-MB,肌鈣蛋白,濃度,急性心肌梗塞后各項指標(biāo)變化,肌紅蛋白,升高,高峰,回落,肌酐激霉MB,肌鈣蛋白I,1-2 h,4-8h,6-8h,5-12h,10-24h,12-24h,18-30h,48-72h,5-7d,肌紅蛋白的臨床意義,早期診斷,特異性低,靈敏度高,急性心梗后最早(1-2h)出現(xiàn)

19、的標(biāo)記,最早能排除非急性心梗,陰性預(yù)測率為 99 %,體內(nèi)周期短，對重發(fā)梗塞特別靈敏,肌紅蛋白測定能有效分辨非急性心梗，使急性心梗病人能盡早得到治療.,有效觀察溶栓療效,肌鈣蛋白I的臨床意義,診斷急性心肌梗塞特異性 98 %,特異性強、確診率高,靈敏度低,急性心梗發(fā)病后6 h才出現(xiàn)，應(yīng)與肌紅蛋白一同使用,肌鈣蛋白I升高即可確診為急性心肌梗塞，得到治療,體內(nèi)周期長，對外地病人延誤求診亦能診斷,對極輕微的心肌創(chuàng)傷都能檢出,胸痛,ECG,發(fā)病,肌鈣蛋白I,肌紅蛋白 CK-MB,急性心梗,+,+,+, 8h, 8h,隨訪,+,復(fù)發(fā)心梗,肌紅蛋白,注意事項,肌酐激霉MB,骨骼肌損傷肌紅蛋白升高,腎功能衰竭 CK-MB 增高,甲狀腺功能診斷,T3 T4 TSH TSH-3,FrT3 FrT4 Tup,腫瘤標(biāo)志物,CA-199 CA-153 CA-125,PSA AFP CEA,CA 系列 一組糖粘蛋白類腫瘤標(biāo)志物，為細胞膜上的糖脂質(zhì)，因分別被鼠單克隆抗體199、153、125識別得名。,乳癌腫瘤標(biāo)志物,存在于胎兒胰、腸、卵巢、子宮、膽上皮等處及乳腺癌組織。,CA 125,存在胚胎體腔上皮細胞中，出生后消失，卵巢癌細胞中重新出現(xiàn)。,卵巢癌腫瘤標(biāo)志物,CA 199,分布于胎兒胰、膽囊、肝、腸及正常人胰、膽管上皮等處。,胃腸癌腫瘤標(biāo)志物,