1、1,細(xì)胞苗培養(yǎng)技術(shù),一、制備細(xì)胞用物品的處理及準(zhǔn)備 二、細(xì)胞培養(yǎng)用溶液的配制及保存 三、雞胚成纖維細(xì)胞的制備 四、細(xì)胞調(diào)PH值、接毒 五、細(xì)胞的收獲 六、半成品效價(jià)的內(nèi)控指標(biāo),2,一、制備細(xì)胞用物品的處理及準(zhǔn)備,玻璃器皿的處理 橡膠制品的處理 物品的準(zhǔn)備,3,1玻璃器皿的處理,先用自來水簡(jiǎn)單刷洗，然后用清潔液浸泡過夜，不應(yīng)少于6小時(shí)，以中和其中的堿物質(zhì)，用水沖洗 再用毛刷沾洗滌劑刷洗，刷洗要適度，過度會(huì)損害器皿表面的光澤度 需流水沖洗十次以上，然后用注射水清洗3-5 次，晾干備用,4,清潔液 常用三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml） 強(qiáng)清潔液 631000200 次強(qiáng)清洗液 120

2、 2001000 弱清潔液 100 1001000,5,配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色,6,膠塞類橡膠用品，先用蒸餾水浸泡，然后用2%NaOH溶液煮沸1520 min，用自來水沖洗干凈 再用 1稀鹽酸溶液浸泡30 min，再用自來水沖洗 純化水漂洗23次，最后注射水漂洗1次，烤干后備用。,2.橡膠制品的處理,7,3.物品的準(zhǔn)備,1000ml燒杯、500ml燒杯、平皿、剪子、眼科鑷子、抽濾瓶、注射器、單根管道、長管道、抽濾瓶塞子、500ml瓶塞、消化瓶、轉(zhuǎn)瓶,8,10倍漢克氏液、10倍乳漢

3、液、犢牛血清、7.5%碳酸氫鈉、0.25%胰蛋白酶、雙抗、注射水,9,細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。 需要用新鮮的注射水或去離子水,10,細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染 濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：126，60min 干烤：160, 2 小時(shí),11,二細(xì)胞培養(yǎng)用溶液的配制及保存,10倍濃縮乳漢液（10000ml）保存于2-8 氯化鈉 800g 氯化鉀 40g 七水硫酸鎂 20g 二水磷酸氫二鈉 15.2g 磷酸二氫鉀 6g 無水氯化鈣 14g 葡萄糖 110g 1%苯酚紅 60ml 水解乳蛋白 500g,12,0.25%胰蛋白酶（10000ml)

4、保存于-15 氯化鈉 80 氯化鉀 2 二水合枸櫞酸三鈉9.46 磷酸二氫鈉0.56g 碳酸氫鈉 10g 葡萄糖 110g,13,7.5%碳酸氫鈉（10000ml)保存于2-8 碳酸氫鈉 750g 雙抗溶液（20000/ml）保存于-15 青霉素 125瓶*160 鏈霉素 200瓶*100,14,滅菌方法,培養(yǎng)細(xì)胞所用溶液的除菌方法，均為0.22微米過濾除菌。 每次配好后留樣，培養(yǎng)72小時(shí)，觀察培養(yǎng)液確實(shí)沒有污染后使用,15,濾 器,Zeiss濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌,16,平衡鹽液體的作用,組織細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體，可以維持滲透壓、調(diào)

5、節(jié)pH值、供給細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子成分 用于洗滌組織、細(xì)胞等,17,胰蛋白酶溶液的作用,主要作用：使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散 消化完細(xì)胞時(shí)，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用,18,酚紅的作用,大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH 指示 紅色表示中性pH，黃色代表酸性pH，紫色表示堿性pH 在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅,19,血清的作用,提供有利于細(xì)胞生長增殖所需的激素、生長因子或提供合成培養(yǎng)基所缺乏的營養(yǎng)物質(zhì)。 血清還含有多種未知的促細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)，能促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖和貼附。,20,三、雞胚成纖維細(xì)胞的制備,流程圖 SPF種蛋10日發(fā)育健康胚胚

6、表面消毒無菌手術(shù)取出雞體洗2-3次去頭剪碎組織洗2-3次加入0.25%胰蛋白酶36.5-37.5消化（期間每過5-10分鐘輕搖一次）分散過濾細(xì)胞分入轉(zhuǎn)瓶溫室培養(yǎng)36.5-37.5,21,由于有關(guān)培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染,22,貼壁細(xì)胞一般有兩種形狀,即上皮細(xì)胞形和成纖維細(xì)胞形細(xì)胞。,23,上皮細(xì)胞形細(xì)胞呈扁平的不規(guī)則多角形,圓形核位于中央,生長時(shí)常彼此緊密連接成單層細(xì)胞片。,上皮細(xì)胞,24,成纖維細(xì)胞,成纖維細(xì)胞形細(xì)胞形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形態(tài)相似,胞體呈梭形或不規(guī)則三角形,中央有圓核,胞質(zhì)向外伸出23個(gè)長短不同的突起。,25,

7、由于培養(yǎng)基內(nèi)有pH指示劑的存在,因此它的顏色往往可以間接地表明細(xì)胞的生長狀態(tài)。呈橙黃色，細(xì)胞一般生長狀態(tài)較好；呈淡黃色時(shí),則可能是培養(yǎng)時(shí)間過長,營養(yǎng)不足,死亡細(xì)胞過多；如呈紫紅色,則可能是細(xì)胞生長狀態(tài)不好,或已死亡。 一種細(xì)胞在培養(yǎng)中的形態(tài)并不是永恒不變的,它隨營養(yǎng)、pH、生長周期而改變,但在比較穩(wěn)定的條件下形態(tài)基本是一致的。,26,四、細(xì)胞調(diào)PH值、接毒,培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞長成致密單層，加7.5%碳酸氫鈉，調(diào)PH值至7.2 雞痘接毒：將雞痘絨毛尿囊膜按營養(yǎng)液量0.1-0.3%加入 法氏囊接毒：按營養(yǎng)液量的0.8-1%加入,27,正常情況下，培養(yǎng)液pH介于7.27.4之間，呈桃紅色清亮透明。

8、培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞代謝會(huì)使培養(yǎng)液pH值下降，引起顏色變淺變黃。,28,細(xì)胞在培養(yǎng)過程中需要每天進(jìn)行常規(guī)檢查和顯微鏡觀察，及時(shí)了解細(xì)胞生長狀態(tài)、數(shù)量改變、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞有無移動(dòng)、有無污染、培養(yǎng)液pH是否變酸、變黃是否更換等。,29,生長良好的細(xì)胞，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清。,細(xì)胞,30,細(xì)胞,若細(xì)胞生長狀態(tài)不良，可見細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折光性變?nèi)?，?xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落，有時(shí)細(xì)胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。發(fā)現(xiàn)這種情況應(yīng)及時(shí)處理。,31,五、細(xì)胞的收獲,當(dāng)CPE達(dá)到75%，細(xì)胞由纖維狀變圓、變暗、遮光度增強(qiáng)、并出現(xiàn)大量融合細(xì)胞即可收獲,32,毒液保存,毒液放入-15冷庫保存。雞痘保存期不超過1個(gè)月，法氏囊保存期不超過3個(gè)月。細(xì)胞毒凍干之