1、植物組織培養(yǎng)技術(shù),李蘭芝 生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院,A Glimpse of Plant Tissue Culture,主要內(nèi)容：,概述,植物組織培養(yǎng)含義,組織培養(yǎng)的類型,植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史,植物組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用,本節(jié)教學(xué)目的與要求,(1) 掌握組織培養(yǎng)的概念和類型； (2) 掌握組織培養(yǎng)的特點(diǎn)； (3) 了解組織培養(yǎng)發(fā)展史； (4) 初步掌握組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)實(shí)踐上的應(yīng)用。,一、什么是植物組織培養(yǎng)What Is Tissue Culture? Or in vitro culture? Or micropropagation?,（一）概念：,器官（organ)：根、莖、葉、花、果實(shí)、種子,組

2、織（tissue)：花藥、胚珠、胚、胚乳、形成層等,植物組織培養(yǎng)（Tissue culture） 是指用無菌方法使植物體的離體（in vitro)器官、組織和細(xì)胞在人為提供的條件下生長和發(fā)育的所有培養(yǎng)技術(shù)的總稱，也稱之為離體培養(yǎng)（In vitro culture）或試管培養(yǎng)。,Characteristics of Plant Tissue Culture Techniques,培養(yǎng)條件可以人為控制,生長周期短，繁殖率高,植物組織培養(yǎng)特點(diǎn),管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制,（二）植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)細(xì)胞全能性,1、細(xì)胞全能性（cell totipotency) ：植物體的每一個(gè)具有完整細(xì)胞

3、核的細(xì)胞都具有該物種全部遺傳的物質(zhì)，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。,2、植物細(xì)胞全能性的表達(dá),脫分化（dedifferentiation)：將已分化的不分裂的靜止細(xì)胞，放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，細(xì)胞重新進(jìn)入分裂狀態(tài)。一個(gè)成熟的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過程叫脫分化。,一個(gè)細(xì)胞一旦沿著某一條特定的途徑分化發(fā)育后，一般不會(huì)再回復(fù)到未分化狀態(tài)，但在組織培養(yǎng)條件下，可能發(fā)生脫分化和再分化。,再分化（redifferentiation):經(jīng)脫分化的組織或細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下可轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同的細(xì)胞類型，形成完整植株的過程。,脫分化,愈傷組織,再分化,根 芽,再生植株,3、植物組織培養(yǎng)過程,合適的外植體

4、 離體的植物器官、組織、細(xì)胞,移栽,外植體（explant)：由活體（in vivo)植物體上切取下來的，用于組織培養(yǎng)的各種接種材料。包括各種器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等。即能被誘發(fā)產(chǎn)生無性增殖系的器官或組織切段。,胡蘿卜離體根,愈傷組織（callus）在人工培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團(tuán)無序生長狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。指經(jīng)細(xì)胞與組織培養(yǎng)產(chǎn)生的可傳代的未分化細(xì)胞。,4、組織培養(yǎng)植株再生的途徑,魔芋胚狀體,1）、體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑（胚狀體發(fā)生途徑） ： 是指在組織培養(yǎng)中起源于一個(gè)非合子細(xì)胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程（經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚5個(gè)時(shí)期），形成具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)，而發(fā)育成再

5、生植株的途徑。,胚狀體發(fā)生途徑,外植體,脫 分 化,愈傷組織,胚狀體,再生植株,再 分 化,2）、器官發(fā)生途徑： 由愈傷組織或外植體誘導(dǎo)形成不定根或不定芽，再獲得再生植株的方法。,百合鱗葉培養(yǎng),外植體器官發(fā)生途徑,愈傷組織,芽分化,再生苗,胚狀體,小麥,愈傷組織器官發(fā)生途徑,外植體,愈傷組織,芽,根,再生植株,脫分化,再分化,高生長素(1,2-D),高(生長素/細(xì)胞分裂素),低(生長素/細(xì)胞分裂素),器官發(fā)生途徑,愈傷組織,按培養(yǎng)材料分為（Gamborg等)：,愈傷組織培養(yǎng) 器 官 培 養(yǎng) 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 原生質(zhì)體培養(yǎng),最為常見的組織培養(yǎng),懸浮細(xì)胞培養(yǎng) 單細(xì)胞培養(yǎng),胚、胚乳、珠心、子房、根、莖

6、、葉、花和幼果的部分組織的培養(yǎng),（三）、植物組織培養(yǎng)的類型,根據(jù)培養(yǎng)器官的不同： 葉培養(yǎng)、根培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、莖尖培養(yǎng)等,煙草,（三）、植物組織培養(yǎng)的類型,根據(jù)培養(yǎng)方式：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng) 固體培養(yǎng)：將培養(yǎng)物放在含有瓊脂等固化劑的培養(yǎng)基表面進(jìn)行培養(yǎng)。 液體培養(yǎng)：將培養(yǎng)物放在未加固化劑的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，一般需進(jìn)行震蕩，又稱液體震蕩培養(yǎng)。,（三）、植物組織培養(yǎng)的類型,固體培養(yǎng),液體培養(yǎng),(1)固體培養(yǎng)法 是最常用的方法。該方法簡單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。 (2)液體培養(yǎng)法 由于液體中氧氣含量較少，常用振動(dòng)培養(yǎng)的方法以確保氧氣的供給 往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖

7、床進(jìn)行培養(yǎng)，速度一般為50-200rmin，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。,固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)的特點(diǎn)：,根據(jù)培養(yǎng)物量的多少： 大量培養(yǎng)、微量培養(yǎng)。 根據(jù)培養(yǎng)過程中是否需光： 光培養(yǎng)、暗培養(yǎng) 根據(jù)培養(yǎng)方法的不同： 平板培養(yǎng)、微室培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)等,（三）、植物組織培養(yǎng)的類型,按培養(yǎng)過程分為:初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng),初代培養(yǎng)（Primary culture）： 指外植體的最初培養(yǎng)。 繼代培養(yǎng)（Subculture）： 將初代培養(yǎng)得到的培養(yǎng)體移植于新鮮培養(yǎng)基中這種反復(fù)多次移植的培養(yǎng)，稱為繼代培養(yǎng)。,（三）、植物組織培養(yǎng)的類型,二、植物組織培養(yǎng)發(fā)展簡史,1、萌芽階段：(從20世紀(jì)

8、初到30年代中）,1838-1839年，德國科學(xué)家Schleide 和Schwann發(fā)表了細(xì)胞學(xué)說，奠定了組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。 1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt 根據(jù)細(xì)胞學(xué)說，提出植物細(xì)胞全能性（totipotency）理論。 1904年，Hanning 最先成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚。 1922年，Knudson 采用胚培養(yǎng)法獲得大量蘭花幼苗?？朔浞N子發(fā)芽困難的問題 1925年：Laibach亞麻種間雜交幼胚培養(yǎng)得到雜種,玉米成熟胚的培養(yǎng),Haberlandt：,觀點(diǎn)：,貢獻(xiàn)：,提出細(xì)胞全能性,首次進(jìn)行離體細(xì)胞培養(yǎng),高等植物的組織和器官可以分割成單個(gè)細(xì)胞,1934年，美國植物

9、生理學(xué)家White 用番茄根尖建立起第一個(gè)活躍生長的無性繁殖系，從而使非胚器官的培養(yǎng)首先獲得成功。,2、奠基階段（從20世紀(jì)30年代末到50年代中）,1934年：Gautherete培養(yǎng)山毛楊、黑楊形成層組織產(chǎn)生了Callus,1937年：White發(fā)現(xiàn)3種B族維生素和IAA對(duì)植物生長有用,1939年：Gautherete培養(yǎng)胡蘿卜根小外植體成功,1939年：White培養(yǎng)煙草種間雜種幼莖切段原形成層成功,1939年：Nobecourt培養(yǎng)胡蘿卜根塊莖薄壁組織成功,組織培養(yǎng)的奠基人,3、快速發(fā)展和應(yīng)用階段（從20世紀(jì)50年代末至今）,1958年，英國科學(xué)家Steward 等用胡蘿卜根的愈傷組織

10、細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出胚狀體并分化為完整的小植株。這是第一次實(shí)現(xiàn)人工體細(xì)胞胚，是植物組織培養(yǎng)的第一個(gè)突破。 1960年英國學(xué)者Cocking用酶法分離原生質(zhì)體成功。這是植物組織培養(yǎng)的第二個(gè)突破。 1962年，Murashinge 和Skoog 在煙草培養(yǎng)中篩選出至今仍被廣泛使用的MS培養(yǎng)基。 1964-1966年，印度科學(xué)家Guha 和Maheswari 在曼陀羅花藥培養(yǎng)中首次由花粉誘導(dǎo)得到了單倍體植株。 1972年，Carlson 通過兩個(gè)種的煙草原生質(zhì)體融合培養(yǎng)，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜交的雜種植株。,三、應(yīng)用領(lǐng)域,1、快速繁殖,2、種苗脫毒,3、遠(yuǎn)緣雜交,8、植物性藥物和生物制品的生產(chǎn)

11、,7、基因工程,6、種質(zhì)保存,4、突變育種,5、單倍體育種,四、植物組織培養(yǎng)在技術(shù)上的發(fā)展,研究材料范圍逐步擴(kuò)大 培養(yǎng)方法逐步完善 培養(yǎng)基不斷改進(jìn) 實(shí)驗(yàn)手段逐步完備,植物再生植株的途徑,小結(jié)：,(1)植物組織培養(yǎng)是指分離單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或植物體的一部分，在人工配制的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，使之長成一株完整植物體的過程。 (2)類型：按照外植體的不同，分為植株培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)5種類型。 (3)組織培養(yǎng)特點(diǎn)：培養(yǎng)條件可以人為控制；生長周期短，繁殖率高；管理方便，利于工廠化生產(chǎn)的突出特點(diǎn)，因而發(fā)展迅速。 (4)組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用主要體現(xiàn)于以下幾個(gè)方面：快速繁殖優(yōu)良

12、苗木；獲得脫毒苗；育種上應(yīng)用；工廠化育苗。,植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室 構(gòu)建及操作技術(shù),植物組織培養(yǎng)學(xué),本節(jié)教學(xué)目的與要求：,(1)掌握組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)； (2)掌握組織培養(yǎng)常用的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及其使用方法； (3)掌握調(diào)控組織培養(yǎng)的主要環(huán)境條件。 (4)掌握滅菌和消毒的區(qū)別； (5)掌握滅菌的不同方法和具體操作過程；,商業(yè)性組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室和小工廠的設(shè)計(jì)與主要設(shè)備 培養(yǎng)基及其配制 外植體的選擇與培養(yǎng) 試管苗的馴化與移栽,本節(jié)主要內(nèi)容,1、培養(yǎng)器皿的清洗； 2、培養(yǎng)基的配制、分裝和高壓滅菌； 3、無菌操作材料的表面滅菌和接種； 4、將培養(yǎng)物放到培養(yǎng)室培養(yǎng)； 5、試管苗的馴化、移栽和初期管理。,一 商業(yè)

13、性組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室和小工廠的 設(shè)計(jì)與主要設(shè)備,一般組織培養(yǎng)的操作工序：,一、設(shè)計(jì)：,二、儀器設(shè)備和器皿用具,1、超凈工作臺(tái)或接種箱 2、空調(diào) 3、除濕機(jī)或加濕器 4、恒溫培養(yǎng)箱 5、高壓滅菌鍋 6、冰箱 7、天平 8、顯微鏡 9、水浴鍋 10、搖床與轉(zhuǎn)床 11、蒸餾水發(fā)生器 12、酸度計(jì) 13、離心機(jī),（一）常見儀器設(shè)備,組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的 設(shè)計(jì)與主要設(shè)備,1、培養(yǎng)器皿：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、 圓形培養(yǎng)瓶、果醬瓶2、分注器3、離心管4、刻度移液管5、細(xì)菌過濾器6、實(shí)驗(yàn)器皿：量筒、燒杯、容量瓶、 試劑瓶、塑料瓶、酒精燈等。,組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的 設(shè)計(jì)與主要設(shè)備,（二）各類玻璃器皿,1、鑷子：尖頭鑷子、槍

14、形鑷子 2、剪子 3、解剖刀 4、接種針 5、鉆孔器,組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的 設(shè)計(jì)與主要設(shè)備,（三）器械用具,二 培養(yǎng)基及其配制,本節(jié)目的要求：(1)一般掌握培養(yǎng)基的種類、特點(diǎn)；(2)掌握基本培養(yǎng)基的配方；(3)一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量；(4)掌握培養(yǎng)基母液和常用培養(yǎng)基的配制方法；(5)熟練掌握培養(yǎng)基的滅菌方法；(6)一般掌握培養(yǎng)基的篩選辦法。,一、培養(yǎng)基的成分,培養(yǎng)基及其配制,1、無機(jī)營養(yǎng)元素(inorganic element),1)大量元素：指濃度大于0.5mmolL的元素。 N、P、K、Mg、S和Ca等。,2)微量元素：指小于0.5mmolL的元素。 Fe，B，Mn，Cu，Mo，

15、Co等。,培養(yǎng)基及其配制,2、有機(jī)化合物(organic compound),最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源。 使用濃度在1%5%，常用3% 作用：碳源；維持培養(yǎng)基滲透壓。,（1）碳水化合物,培養(yǎng)基及其配制,在細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)。 種類：VBl(鹽酸硫胺素)、 VB6(鹽酸吡哆醇)、 Vpp(煙酸)、 Vc（抗壞血酸）、 VH(生物素)、 VB11(葉酸)、 VB12（鈷胺素)等。 使用濃度：一般用量為0.11.0mgL。,（2）維生素(vitamin),培養(yǎng)基及其配制,又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。 使用濃度：一般為lOOmgL， 作用

16、：適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞壁的形成也有作用。,（3）肌醇,培養(yǎng)基及其配制,作用：是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。 種類：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。 使用濃度：為10200mgL。,（4）氨基酸 (almino acide）,培養(yǎng)基及其配制,3、有機(jī)附加物 （天然復(fù)合物）,10%20%,150-200mlL,150200gL,0.01%-0.05%,濃度：,培養(yǎng)基及其配制,4、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(hormone),赤霉素（gibberellic acid）,細(xì)胞分

17、裂素類 ( cytokinin ),生長素類(auxin),培養(yǎng)基及其配制,*作用：主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成；促進(jìn)細(xì)胞脫分化；促進(jìn)細(xì)胞伸長；促進(jìn)生根。 在促進(jìn)生長方面，根對(duì)生長素最敏感。在極低的濃度下，(10-510-8mgL)就可促進(jìn)生長，其次是莖和芽。,（1）生長素類,培養(yǎng)基及其配制,吲哚乙酸：IAA（indo acetic acid） 萘乙酸：NAA（naphthalene acetic acid） 吲哚丁酸：IBA（indolebutyri acid） 2,4-二氯苯氧乙酸：2,4D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid),*生長素種類：,培養(yǎng)基及其配制,

18、IAA(吲哚乙酸),NAA(萘乙酸),IBA(吲哚丁酸),2,4D(2,4二氯苯氧乙酸),生長素作用強(qiáng)弱順序：,強(qiáng),弱,培養(yǎng)基及其配制,種類： 6BA(6芐基腺嘌呤) Kt (kinetin 激動(dòng)素) Zt (zeatin 玉米素),（2）細(xì)胞分裂素類,細(xì)胞分裂素作用： 促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。 誘導(dǎo)芽分化，促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)，使莖增粗，抑制莖伸長。 抑制根的分化。,培養(yǎng)基及其配制,Kt ( 激動(dòng)素),6BA(6芐基腺嘌呤),Zt (玉米素),細(xì)胞分裂素作用強(qiáng)弱順序,強(qiáng),弱,培養(yǎng)基及其配制,GA3（赤霉酸）： 作用：促進(jìn)幼芽伸長生長，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株。 赤霉素和生長素協(xié)同作用，對(duì)形成層的分化有影響

19、：當(dāng)生長素赤霉素比值高時(shí)有利于木質(zhì)部分化，比值低時(shí)有利于韌皮部分化。,（3）赤霉素,培養(yǎng)基及其配制,5、培養(yǎng)材料的支持物 -瓊脂(agar),固體培養(yǎng)時(shí)最好的固化劑。 用量：610gL。 瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40 即凝固為固體狀凝膠。 瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間、pH值等因素有關(guān)，長時(shí)間的高溫會(huì)使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會(huì)使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時(shí)間過久，瓊脂變褐，也會(huì)逐漸喪失凝固能力。,培養(yǎng)基及其配制,固體培養(yǎng)基的特點(diǎn)（與液體培養(yǎng)基相比）:,優(yōu)點(diǎn):操作簡便

20、，通氣問題易解決，便于觀察研究。 缺點(diǎn):培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸(即吸收)面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分充分利用，同時(shí)培養(yǎng)物排出的代謝廢物，聚集在吸收表面，對(duì)組織產(chǎn)生毒害作用。,固體培養(yǎng),液體培養(yǎng),培養(yǎng)基及其配制,6、抗生物質(zhì)(antibiotic),種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。 濃度：520mg/L。 作用：可防止菌類污染。,培養(yǎng)基及其配制,7、活性炭(active carbon),目的：是利用其吸附能力，減少一些有毒物質(zhì)的影響；利于生根。 使用濃度：15gL。 它的顆粒大小決定著吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；溫度低吸附力強(qiáng)，溫度高吸附力減弱，甚至不吸附。,培養(yǎng)基及其配制,

21、8、水（water),作用：是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。 注意：用蒸餾水，最好是重蒸餾水；以保持培養(yǎng)基成分的精確性。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來水。,培養(yǎng)基及其配制,二、培養(yǎng)基的PH值 (pH value),1、多數(shù)植物要求pH5.6-5.8 2、用0.1-1N的NaOH和0.1-1N的HCI調(diào)節(jié). 3、注意： 經(jīng)高壓滅菌后，培養(yǎng)基pH會(huì)下降0.2-0.8,固調(diào)整pH值時(shí),應(yīng)高于0.5； pH的大小會(huì)影響瓊脂的凝固能力，當(dāng)pH6.0時(shí)，培養(yǎng)基將會(huì)變硬，pH 5.0時(shí)，瓊脂凝固不好。,培養(yǎng)基及其配制,培養(yǎng)基及其配制,不同植物對(duì)培養(yǎng)基最適pH值的要求不同(見表),培養(yǎng)基(cul

22、ture medium) ：是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對(duì)營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對(duì)營養(yǎng)的要求也不相同。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。,三、培養(yǎng)基的種類、配方及特點(diǎn),培養(yǎng)基及其配制,1、根據(jù)態(tài)相不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基,2、根據(jù)培養(yǎng)物培養(yǎng)過程：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基,3、根據(jù)作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、 生根培養(yǎng)基,4、根據(jù)營養(yǎng)水平：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、 改良培養(yǎng)基。,（一）培養(yǎng)基的種類,培養(yǎng)基及其配制,若只含有大量元素與微量元素和

23、碳水化合物的培養(yǎng)基，稱為基本培養(yǎng)基。 在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加各種各樣的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他有機(jī)附加物的培養(yǎng)基叫完全培養(yǎng)基。,初代培養(yǎng)基： 指用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基：指用來接種繼初代培養(yǎng)之后的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基 。,培養(yǎng)基及其配制,（二）MS培養(yǎng)基配方,培養(yǎng)基及其配制,1、MS培養(yǎng)基：它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。是目前應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基。 特點(diǎn)：是無機(jī)鹽離子濃度較高，有高含量的N、K，硝酸鹽量大，營養(yǎng)豐富。,（三）常用的培養(yǎng)基及特點(diǎn),培養(yǎng)基及其配制,2、White培養(yǎng)基：1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。 特點(diǎn)：無機(jī)鹽濃度較低

24、，適于生根培養(yǎng)。,3、N6培養(yǎng)基：1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。 特點(diǎn)：是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含鉬。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花粉和花藥培養(yǎng)。,培養(yǎng)基及其配制,(4)B5培養(yǎng)基:是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。 特點(diǎn)：是含有較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素。,(5)KM8P培養(yǎng)基:它是1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。 特點(diǎn)：是有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素。,培養(yǎng)基及其配制,四、 培養(yǎng)基的配制,（一）、母液(stock solution)的配制和保存 所謂母液是欲配制液的濃縮液。 意

25、義: 保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性 配制時(shí)的快速移取 便于低溫保藏。 一般母液配成比所需濃度高10-100倍。 母液配制時(shí)可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和激素類等。,培養(yǎng)基及其配制,單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用mg/ml 或mg/L表示。 混配法：將幾類營養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后再混合成母液。 配制生長素類：可先用少量0.1N的NaOH或95%酒精助溶。濃度為：1-5mgml。 配制細(xì)胞分裂素類：一般先用少量0.5-1N鹽酸加熱溶解。濃度為：1-5mgml。,培養(yǎng)基及其配制,母液的配制方法：,培養(yǎng)基母液的配制,培養(yǎng)基及其配制,（二

26、）培養(yǎng)基的配制及其滅菌,1.配制方法： 1、將母液按順序擺放 2、取適量的蒸餾水(所需培養(yǎng)基量的2/3)入容器 3、按需要量依次取母液及生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 4、加入蔗糖(30g/L)溶解 5、加瓊脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min 5、定容 6、調(diào)PH值(pH=5.8) 7、分裝培養(yǎng)瓶，封口 8、高壓滅菌,培養(yǎng)基及其配制,組織培養(yǎng)常見的滅菌方法,消毒:是指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。,滅菌:是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。,培養(yǎng)基及其配制,常用的滅菌方法,物理方法,化學(xué)方法,干熱滅菌(烘燒和灼燒),濕熱滅菌

27、(常壓或高壓蒸煮),射線處理(紫外線、超聲波、微波),過濾除菌,大量無菌水沖洗,升汞(氯化汞),甲醛(福爾馬林),過氧化氫,高錳酸鉀,來蘇兒,漂白粉,次氯酸鈉,酒精,培養(yǎng)基及其配制,2.培養(yǎng)基的滅菌濕熱滅菌法,培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。 高壓滅菌的原理： 在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在108kPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。,培養(yǎng)基及其配制,將鍋內(nèi)空氣完全排除后，關(guān)閉放氣閥。當(dāng)壓力表上升達(dá)108kPa時(shí)，鍋內(nèi)溫度達(dá)121（在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其

28、高度耐熱的芽孢），維持20-30min。,培養(yǎng)基及其配制,滅菌方法：,過濾滅(除)菌（不耐熱的物質(zhì) ）,一些生長調(diào)節(jié)劑(赤霉素、玉米素)、某些維生素是不耐熱的，常用過濾滅菌-細(xì)菌過濾器方法。 防細(xì)菌濾膜網(wǎng)孔的直徑為0.45m以下，可阻止細(xì)菌細(xì)胞和真菌的孢子通過。,培養(yǎng)基及其配制,空間及物體表面滅菌,培養(yǎng)基及其配制,熏蒸劑:甲醛和高錳酸鉀。,(1)紫外線滅菌,(2)熏蒸滅菌,2.培養(yǎng)基的滅菌濕熱滅菌法,培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。 高壓滅菌的原理： 在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在108kPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121。在

29、此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。,培養(yǎng)基及其配制,第四節(jié) 植物抗病細(xì)胞突變體篩選,抗病細(xì)胞突變體基本原理 抗病細(xì)胞突變體篩選程序 抗病細(xì)胞突變體篩選實(shí)例,本節(jié)主要內(nèi)容,基本原理,植物抗病細(xì)胞突變體篩選,利用植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的變異，或由物理、化學(xué)因素誘發(fā)變異，給予一定的選擇壓力，篩選出符合育種目標(biāo)的無性系。,基本程序,植物抗病細(xì)胞突變體篩選,選擇壓力,選擇突變體,分離突變體,鑒定突變體,愈傷組織 細(xì)胞 原生質(zhì)體,保持和利用突變體,愈傷組織：最簡單的細(xì)胞材料，缺點(diǎn)多，普遍采用。 細(xì)胞培養(yǎng)物： 由少數(shù)細(xì)胞集合而成，可彌補(bǔ)愈傷組織的不足。 原生質(zhì)體：最理想的細(xì)胞材料，但分離和培養(yǎng)技術(shù)不完善，不能普遍采用。,植物抗病細(xì)胞突變體篩選,材料選擇,負(fù)選擇法：選擇一種培養(yǎng)基，使得突變細(xì)胞不能生長，野生型細(xì)胞生長。然后加負(fù)選擇劑，可殺死生長分裂細(xì)胞，保留不能生長的