1、第一章 基因工程的主要技術(shù)原理,第三節(jié) 核酸的分子雜交,1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事發(fā)明的。 原理：帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。,1 核酸分子雜交技術(shù),彼此退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，而形成的雙鏈分子。 DNA/DNA的雜交作用：檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間的親源關(guān)系 DNA/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片斷中某種特定基因的位置。,1.1雜種核酸分子,按其分子種類劃分 1） DNA雜交探針為DNA或RNA 2）

2、 RNA雜交探針為DNA或cDNA,1.2核酸雜交的類型,3） 蛋白質(zhì)免疫分析探針為抗體,按樣品制備過程劃分 1） 原位雜交(in situ hybridization) i. 原位菌落雜交 ii. 原位噬菌斑雜交 iii. 原位細(xì)胞雜交 iv. 原位組織塊雜交,1.2核酸雜交的類型,起源于標(biāo)準(zhǔn)的光學(xué)顯微鏡技術(shù)，這種技術(shù)曾被用來觀察細(xì)胞分裂期的染色體形態(tài)。 對(duì)于許多生物體來說，可以通過染色體的形狀或者不同方法的染色來區(qū)分。 原位雜交提供了一種通過在光學(xué)顯微鏡下觀察染色體的圖像，直接定位克隆基因的方法。,原位雜交,原位雜交的優(yōu)點(diǎn) 不僅能夠鑒定出基因存在于哪條染色體上， 還可以提供染色體上基因位置

3、的相關(guān)信息。,特點(diǎn)： 原位裂解細(xì)胞，不需要分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)樣品， 可同時(shí)處理大量樣品，常用于目的基因的篩選或檢測(cè)某類細(xì)胞或組織中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白質(zhì)序列。,例如：菌落雜交 原位雜交之一，是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結(jié)合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標(biāo)記特異的DNA或RNA探針雜交。 目的：鑒定重組子。,檢測(cè)重組體克隆的菌落雜交技術(shù),經(jīng)固定劑處理的細(xì)胞被黏附在載玻片上，然后用核糖核酸酶和氫氧化鈉降解RNA，并使DNA分子變性，單個(gè)多聚核苷酸鏈之間的配對(duì)堿基被拆散，而且染色體也在一定程度上被拆開，暴露出通常被包裹在它們結(jié)構(gòu)

4、之中的DNA片段。 將一定量的被標(biāo)記的基因摻入到制備好的染色體中。 標(biāo)記基因和它的染色體拷貝雜交，最終在放射性自顯影中形成一個(gè)黑點(diǎn)。這個(gè)黑點(diǎn)的位置表示標(biāo)記的基因在染色體上的位置。 盡管技術(shù)較難，但人們已經(jīng)利用原位雜交和放射性標(biāo)記的探針，定位人類細(xì)胞遺傳圖譜上相當(dāng)數(shù)量的基因。,原位細(xì)胞雜交,人們用熒光標(biāo)記物替代放射性標(biāo)記，將它連接到雜交探針上，探針與DNA分子雜交后，可以通過熒光顯微鏡直接觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果使用不同的熒光染料，可以同時(shí)探測(cè)兩個(gè)或更多的基因，通過熒光顏色間明顯的差異可以分辨出不同的雜交信號(hào)。 FISH經(jīng)常與已知正常染色體位置的探針一起使用，這項(xiàng)技術(shù)對(duì)于研究染色體已經(jīng)重新排列的細(xì)胞特

5、別有用。 染色體重新排列，例如染色體復(fù)制，或者是某一DNA片段從一條染色體轉(zhuǎn)移到另一條染色體上，都能夠通過FISH相對(duì)較快地測(cè)定出來，比傳統(tǒng)的染色技術(shù)快很多。,熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH),2）斑點(diǎn)雜交(dot hybridization) 先分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)，然后將樣品液直接點(diǎn)在固體基質(zhì)上進(jìn)行雜交，不能測(cè)定分子量大小。,先純化樣品，然后使不同大小的分子在凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到固體基質(zhì)上，與探針雜交。該法可檢測(cè)出感興趣分子的分子量。用于轉(zhuǎn)移的方法有： i. 擴(kuò)散法 ii. 毛細(xì)管法 iii. 電泳轉(zhuǎn)移法 iv. 真空轉(zhuǎn)移

6、法,3）轉(zhuǎn)移雜交或印跡雜交(blotting hybridization),它利用兩種探針與待測(cè)DNA結(jié)合，先將不帶標(biāo)記的探針固定在基質(zhì)上，然后用待測(cè)樣品與之雜交，洗去非特異性結(jié)合后，再與第二種帶標(biāo)記的探針雜交。這種方法可用于粗制DNA樣品，可檢測(cè)出0.2ng的DNA樣品,4) 夾心雜交法(sandwich hybridization),1) DNA和RNA的雜交 制備DNA或RNA樣品與固定基質(zhì)結(jié)合80真空固定預(yù)雜交加入標(biāo)記探針雜交洗滌放射自顯影或顯色反應(yīng)。 2）蛋白質(zhì)的免疫分析 制備蛋白質(zhì)樣品與固定基質(zhì)結(jié)合常溫空氣中固定封閉劑封閉 一抗反應(yīng)洗滌二抗-酶偶聯(lián)物反應(yīng)洗滌顯色反應(yīng)（EIA） 或

7、一抗放射標(biāo)記物洗滌放射自顯影（RIA）,2 分子雜交的一般程序,2.1 雜交樣品膜的制備,1. 固定基質(zhì)的種類與特性 1）硝酸纖維素濾膜 (Nitrocellulose filter, NCF) 可與三類大分子的結(jié)合，其機(jī)理不清楚，可能為被動(dòng)吸附。 NCF不能結(jié)合小分子DNA，RNA和蛋白質(zhì)（20,000）,優(yōu)點(diǎn)： i. 用于DNA，RNA雜交分析時(shí)結(jié)果可靠，靈敏，本底低。 ii. 用于蛋白質(zhì)分析時(shí)，容量大（80g/cm2)；可直接染色；分辨率高； 不需要預(yù)激活；易于操作 缺點(diǎn)： 結(jié)合低分子蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，反復(fù)使用探針次數(shù)有限（2-3次）,硝酸纖維素濾膜NCF,硝酸纖維素膜 不能滯留小于150b

8、p的DNA片斷，不能同RNA結(jié)合。 應(yīng)用1mol/L醋酸銨和0.2mol/L的NaOH緩沖液代替SSC緩沖液可改善對(duì)小片斷DNA的滯留能力。 RNA變性后也能十分容易的結(jié)合到膜上。,2）重氮化紙：DBM紙與DPT纖維素紙 最大特點(diǎn)：能結(jié)合小分子的DNA，RNA和蛋白質(zhì)，共價(jià)結(jié)合，可用不同探針進(jìn)行多次雜交分析。 該類基質(zhì)結(jié)合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白質(zhì)時(shí)最好用放射性標(biāo)記物。這類基質(zhì)對(duì)生物大分子是主動(dòng)吸附。,i. 陽(yáng)離子尼龍膜（如Zeta-prob，Zeta-bind等） i) 容量大, 蛋白質(zhì)可結(jié)合480g/cm2 ii) 可結(jié)合不同大小的DNA(6n.t.)，RNA和蛋白質(zhì)。 ii

9、i)韌性好 iv) 可用于電轉(zhuǎn)移 v) 可進(jìn)行反復(fù)多次雜交試驗(yàn) vi) 廣泛的化學(xué)耐受性和可高溫消毒 *不能用于蛋白質(zhì)的直接染色 ii. 尼龍66 廣泛用于核酸印跡分析，靜電荷可從pH4時(shí)陽(yáng)離子狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閜H7時(shí)陰離子狀態(tài)。,3) 尼龍膜,4）離子膜 i. DEAE-纖維素紙(可用于ss-DNA, ds-DNA, RNA的制備回收) ii. CM-纖維素紙 (可用于堿性蛋白質(zhì)的結(jié)合),固定基質(zhì)的選擇依據(jù),1）強(qiáng)度，耐久性，操作簡(jiǎn)便 2）高信噪比（低本底高信號(hào)） 3）生物大分子的結(jié)合容量和穩(wěn)定性 4）重現(xiàn)性好,核酸雜交常用幾種膜的性能比較,尼龍膜或硝酸纖維素膜雜交的步驟： 1. 核酸印跡轉(zhuǎn)移：將

10、核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持膜上。利用的是毛細(xì)管作用 2. 印跡雜交： 將具有核酸印跡的濾膜同帶有標(biāo)記的DNA/RNA進(jìn)行雜交。,1）原位雜交樣品膜的制備,2.2 各種雜交樣品膜的制備,2） 斑點(diǎn)雜交樣品膜的制備 制備樣品點(diǎn)樣固定（可用斑點(diǎn)雜交儀或直接點(diǎn)樣）,3）轉(zhuǎn)移雜交樣品膜的制備 i. 擴(kuò)散法（Difusion blotting method ),ii. 毛細(xì)管法 (Capillary blotting method ),Southern 印跡,iii. 電轉(zhuǎn)移法 (electro blotting ),iv. 真空轉(zhuǎn)移法 (Vaccum bllotting ) 轉(zhuǎn)移速度與凝膠的速度和厚度成反比

11、，在相同轉(zhuǎn)移率（50%）時(shí)，真空法比毛細(xì)管法快13倍，其損失僅6%，而毛細(xì)管法損失率20%。,v. 各種轉(zhuǎn)移方法的比較 i) 擴(kuò)散法和毛細(xì)管法：操作簡(jiǎn)便，不需要特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低,（擴(kuò)散法為70%，毛細(xì)管法80%）耗時(shí)多。 ii) 電轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對(duì)轉(zhuǎn)移條件要求較嚴(yán)。 iii) 真空轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。,i) 固定基質(zhì)的選擇 ii) 轉(zhuǎn)移前預(yù)處理：DNA和RNA分子變性，蛋白質(zhì)則需除去凝膠中的SDS。 iii)大分子的轉(zhuǎn)移 對(duì)于分子量較大的DNA片段，必須進(jìn)行原位斷裂后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移，斷裂DNA分子最佳長(zhǎng)度為1-2kb。,vi. 轉(zhuǎn)移的最佳條

12、件,其步驟是： 0.25M HCl處理凝膠兩次（每次15分鐘）水洗0.5M NaOH/1M NaCl兩次，每次15分鐘轉(zhuǎn)移。 對(duì)于大分子蛋白質(zhì)，可采用下述三種方法之一： 解偶聯(lián)劑使凝膠解聚；蛋白酶作用；轉(zhuǎn)移緩沖液中加入SDS。,1. 標(biāo)記化合物的種類 1）放射性同位素標(biāo)記物,125I，3H，14C用于蛋白質(zhì)標(biāo)記；32P，3H，35S用于核酸標(biāo)記， 其中32P和35S使用頻率高。 32P標(biāo)記核苷酸的位或位，35S則是標(biāo)記核苷酸的位.,2.3 標(biāo)記探針的制備,2) 非放射性標(biāo)記物 i. 生物素 分離自蛋黃的水溶性維生素，它可以和分離自蛋清中的一種堿性蛋白抗生物素蛋白牢固地結(jié)合。每個(gè)抗生物素蛋白可結(jié)

13、合4個(gè)生物素分子。此外，鏈霉菌抗生蛋白與生物素結(jié)合更牢固，可大大提高其靈敏度。 生物素可以經(jīng)過化學(xué)法與不同的化合物結(jié)合形成標(biāo)記化合物。,ii. 半抗原 包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配體和金屬銪。 地高辛配體是一種脂質(zhì)半抗原，可將其連在dUTP上，然后用酶將其摻入新合成鏈中。檢測(cè)上述標(biāo)記物的方法是利用二抗-酶偶聯(lián)物反應(yīng)和顯色反應(yīng)。,iii. 蛋白質(zhì)檢測(cè)標(biāo)記物 i) 酶偶聯(lián)二抗（0.05ng） ii) 蛋白質(zhì)A（來自金黃色葡萄球菌）。 可作用于大多數(shù)哺乳動(dòng)物的IgG，靈敏度較低（5ng） iii) 免疫金（immunogold） 0.1-0.5ng,3) 兩類標(biāo)記化合物的比較 i. 靈敏度

14、檢測(cè)蛋白質(zhì)，兩種方法差不多。 檢測(cè)核酸，放射法比酶法敏感。 ii. 穩(wěn)定性 酶法探針可在4保存一年，放射性標(biāo)記需每次制備。 iii. 安全性 非放射性標(biāo)記安全。 iv. 效率 非放射性標(biāo)記所需時(shí)間短。,2. 標(biāo)記探針的制備 1）鏈標(biāo)記法 i. 切口移位法 ds-DNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32P-dCTP) ii. 隨機(jī)DNA引物延伸法 ds-DNAss-DNA-(6n,t)Klenow片段+dNTP(32P),iii. 反轉(zhuǎn)錄法 mRNA+dNTP(32P) cDNA（標(biāo)記） iv. 轉(zhuǎn)錄法 含有待標(biāo)記DNA片段的重組質(zhì)粒+NTP(32P)RNA（標(biāo)記） v. 引物延

15、伸法 含待標(biāo)記DNA的單鏈DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32P)待標(biāo)記DNA鏈,vi. T4 DNA聚合酶法 ds-DNAT4 DNA聚合酶, 無dNTP3-5外切酶活性加入dNTP和標(biāo)記核苷酸新合成鏈（32P）,2) 末端標(biāo)記 i. 5-末端標(biāo)記 ss-和ds-DNA, RNA脫磷酸化反應(yīng) (CIP) T4DNA激酶(-32P )ATP ii. 3-末端標(biāo)記 i) TdT加尾反應(yīng)，用于dsDNA,ii) 補(bǔ)齊反應(yīng),iii) T4 RNA連接酶反應(yīng) RNA-OH+*pNp（3-5-二磷酸核苷）+ATPRNA-*pNPp+pA+ppi,3) 標(biāo)記化合物的純化

16、i. 柱層析 利用Sephadex G-50，前峰-標(biāo)記物，后峰-核苷酸 ii. 旋轉(zhuǎn)柱層析 快速，簡(jiǎn)便, 可同時(shí)純化多個(gè)樣品。,2.4 分子雜交與結(jié)果檢測(cè),1. 核酸雜交與結(jié)果檢測(cè) 1）預(yù)雜交： 預(yù)雜交液中常加入鮭魚精DNA，若標(biāo)記探針是cDNA或RNA，預(yù)雜交液中還需加入多聚A以阻止特異性結(jié)合, 42 4-6h或過夜。 2）雜交：探針100變性，迅速冷卻，加入預(yù)雜交液中，42一天,3）洗滌： 2SSC+0.1%SDS常溫洗滌兩次，1SSC+0.1%SDS 65洗滌兩次，每次15分鐘。若使用低聚核苷酸探針，洗滌溫度按下式計(jì)算： T=4GC+2AT * 高強(qiáng)度與低強(qiáng)度雜交：若具高度特異性同源序

17、列，采用高強(qiáng)度雜交條件；若使低同源性DNA之間雜交，則采用低強(qiáng)度雜交條件。這兩種條件之差異表現(xiàn)在雜交液和洗滌液的離子強(qiáng)度以及雜交和洗滌時(shí)的溫度。,4）放射自顯影或顯色反應(yīng) 使用放射性同位素標(biāo)記物，采用放射自顯影。 若采用非放射性同位素標(biāo)記物，則采用顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)將依據(jù)偶聯(lián)的酶類而定。主要有兩種酶： i. 辣根過氧化物酶: 可將3，3-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或?qū)?-氯萘酚氧化成紫色沉淀物。,ii. 堿性磷酸酶的作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下，該化合物可轉(zhuǎn)變?yōu)樘m色沉淀物，該反應(yīng)中釋放的氫離子可將硝基蘭四唑還原成深紫色沉淀，這些沉淀物都是沉積在酶的作用位點(diǎn)。 iii. 兩種

18、酶偶聯(lián)物的比較 i) 堿性磷酸酶的靈敏度比辣根過氧化物酶高10倍左右，但噪聲大。 ii) 堿性磷酸酶的顯色反應(yīng)可持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，其顯色結(jié)果可長(zhǎng)期保存，但辣根過氧化物酶的顯色反應(yīng)僅能持續(xù)30分鐘。 5) 雜交結(jié)果,2. 蛋白質(zhì)的免疫分析 封閉劑，明膠，牛血清蛋白，卵清蛋白等。,3 Southern DNA印跡雜交 由E.Southern于1975年首先設(shè)計(jì)出來的， 根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或 RNA探針的雜交作用，檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。,Southern 凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù),So

19、uthern DNA 印跡雜交之X光顯像圖片 水稻（Oryza sativa L.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標(biāo)記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽(yáng)性條帶 ，表明含有水稻的psbA基因序列。,在進(jìn)行核酸印跡轉(zhuǎn)移的時(shí)， 1. 要將已轉(zhuǎn)好的硝酸纖維素膜在80度下烘烤12小時(shí)； 2. 紫外線交聯(lián)法，將DNA分子上的部分胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面的帶正電荷的氨基基團(tuán)之間進(jìn)行交聯(lián)。,4 Northern RNA印跡技術(shù)（

20、Northern blotting） 1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來， 將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于這種方法與Southern DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做Northern RNA印跡技術(shù)（Northern blotting）。 而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)，這種技術(shù)叫做Western 蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Western blotting）。,5 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Gel retardation assay） 又叫DNA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)

21、（DNA mobility shift assay） 80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，也是當(dāng)前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實(shí)驗(yàn)方法。 原理： DNA與蛋白的結(jié)合導(dǎo)致了電泳時(shí)遷移率的降低。,不僅可以用來鑒定在特殊類型細(xì)胞的提取物中，是否存在與某一特定DNA片斷結(jié)合的蛋白質(zhì)分子 而且可以研究發(fā)生此中結(jié)合之精確的DNA序列的特異性。（加入超量的非標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)DNA）,可以間接的闡明體內(nèi)發(fā)生DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。 1. 用具有已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)DNA，可檢測(cè)蛋白是否屬于此類轉(zhuǎn)錄因子； 2. 在競(jìng)爭(zhēng)DNA的已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上，引入突變可評(píng)估突變對(duì)競(jìng)爭(zhēng)DNA性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的影響。,凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)?zāi)芙沂驹隗w內(nèi)發(fā)生的DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用的有關(guān)信息，但無法確定兩者結(jié)合的準(zhǔn)確部位，而DNase足跡實(shí)驗(yàn)可以解決這個(gè)問題。,6 DNase足跡實(shí)驗(yàn) （footprinting assay） 是一類用于檢測(cè)與特定蛋