1、第三節(jié) 基因工程制藥生產(chǎn)的基本過(guò)程,一、工具酶的分離純化 二、載體的分離純化 三、外源DNA和目的基因的分離和獲得 四、外源DNA與載體DNA的切割與連接 五、宿主細(xì)胞的選擇和基因?qū)氩僮?六、基因工程菌的穩(wěn)定性及生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn) 七、基因工程菌中試 八、基因工程菌的擴(kuò)增和發(fā)酵生產(chǎn) 九、基因工程藥物的分離和純化技術(shù) 十、變性蛋白的復(fù)性 十一、基因工程藥物的質(zhì)量控制 十二、基因工程藥物的制造實(shí)例,血紅蛋白基因,血紅蛋白基因排列順序,血紅蛋白的結(jié)構(gòu),血紅蛋白的運(yùn)送氧氣功能,血紅蛋白的基因工程流程,一、工具酶的分離純化,（一）基因工程制藥所用到的工具酶 （二）關(guān)于限制酶 （三）關(guān)于連接酶,（一）基因工

2、程制藥所用到的工具酶,限制性內(nèi)切酶 甲基化酶 Klenow聚合酶T4-DNA聚合酶 T4-多核苷酸激酶堿性磷酸酶 核酸酶-S1核酸酶-Bal31 綠豆核酸酶 核糖核酸酶 人外切核酸酶DNA酶-1 外切RNA酶-III外切RNA酶-VI DNA聚合酶1 T4-DNA連接酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶T4-RNA連接酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 大腸桿菌-DNA連接酶,（二）關(guān)于限制酶,1、宿主限制現(xiàn)象 2、限制酶的定義 3、限制酶的特征 4、限制酶的作用 5、基因工程所用到的限制酶 6、影響限制酶作用的因素,1、宿主限制現(xiàn)象,病毒或噬菌體在宿主A細(xì)胞中生長(zhǎng)良好,但在宿主B細(xì)胞中生長(zhǎng)很差,原因是它的DNA受到宿主B的限

3、制,這種現(xiàn)象是宿主控制性限制 （restriction）與修飾(modification) ,簡(jiǎn)稱（R/M體系）。 細(xì)菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來(lái)的DNA，并能使后者降解掉。,R/M體系： 是由兩種酶活性配合完成的： 一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶 另一種是核酸內(nèi)切限制酶,E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶,當(dāng)(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化

4、。 EcoB(大腸桿菌B株)的核酸酶不能識(shí)別已甲基化 的序列。,R/M體系的作用： 保護(hù)自身的DNA不受限制； 破壞外源DNA使之迅速降解,ECOB核酸酶,甲基化酶,CH3,CH3,CH3,CH3,噬菌體來(lái)源序列,宿主來(lái)源序列,限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源的一類酶，其功能是避免外源的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。 由于R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。,2、限制酶的定義,凡是能夠識(shí)別和切割DNA分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶稱為限制酶。限制酶分為三個(gè)類型： （1）型限制酶-由于其切點(diǎn)不固定，很難形成特異性的切割末端。 （2）型限制酶-是位點(diǎn)特異性酶

5、，是基因工程理想的工具酶。 （3）型限制酶-對(duì)DNA的識(shí)別與切割點(diǎn)不同，不產(chǎn)生特異性DNA片段。,3、限制酶的特征,具有專一性的識(shí)別位點(diǎn)。 能夠形成固定的核苷酸單鏈末端。 比較適合于進(jìn)行DNA結(jié)構(gòu)的分析和進(jìn)行基因重組。,4、限制酶的作用,（1）進(jìn)行DNA重組。 （2）構(gòu)建新載體。 （3）構(gòu)建基因文庫(kù)。 （4）進(jìn)行DNA序列分析。 （5）制備DNA放射性探針。,5、基因工程所用到的限制酶,通常是型限制酶，具體有以下幾種。 EcoR-IHind-IIIBamH-I Pst-I Sst-ISal-I Ava-I Bcl-IHind-II Hpa-I Bgl-II Cla-I Hae-IIIHha-I

6、Hinf-I Hpa-IIMbo-ISma-I Xba-I Xho-I,6、影響限制酶作用的因素,（1）DNA的純度 （2）DNA的甲基化程度 （3）DNA的結(jié)構(gòu) （4）反應(yīng)的溫度-最適溫度為37度 （5）反應(yīng)的緩沖體系-反應(yīng)體系中通常含有MgCl2、NaCl、KCl、-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、牛血清白蛋白。它們具有激活酶、穩(wěn)定酶的作用。,（三）關(guān)于連接酶,1、定義-凡是能夠催化DNA片段5-末端的磷?；c3-末端的羥基結(jié)合成磷酸二酯鍵的酶，稱為連接酶。 2、作用-主要用于（1）正常DNA的合成。（2）損傷DNA的修復(fù)。 3、種類（1）DNA-連接酶-廣泛存在于生物細(xì)胞之中，主要取自于大腸桿菌E

7、.coli。（2）T4-DNA連接酶-來(lái)自于經(jīng)過(guò)T4-噬菌體感染的大腸桿菌E.coli。 （3 T4-RNA連接酶-催化單鏈DNA或RNA的5磷酸與另一單鏈DNA或RNA的3羥基之間形成共價(jià)連接。,二、基因工程載體的分離純化,（一）定義 （二）基因工程載體的必備條件 （三）基因工程載體的種類,（一）定義,能夠?qū)⒛康幕驍y帶進(jìn)宿主細(xì)胞、并可使得目的基因能夠在宿主體內(nèi)進(jìn)行自主性復(fù)制的遺傳因子，稱為基因工程載體。,（二）基因工程載體的必備條件,（1）具有有效運(yùn)載能力。（2）載體自身能夠獨(dú)立復(fù)制，并且在宿主體內(nèi)進(jìn) 行自主性復(fù)制。（3）載體在攜帶目的基因之后，還能夠在宿主體內(nèi)進(jìn)行自主性復(fù)制。（4）在宿主

8、體內(nèi)，能夠控制外源基因的表達(dá)活動(dòng)。（5）能夠攜帶大小不同的外源性目的基因。（6）鑒定方便、裝卸技術(shù)簡(jiǎn)單。（7）容易控制、安全可靠。,（8）應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)、并且有方便的篩選標(biāo)記。（9）應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子。（10）應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，因?yàn)橥庠椿虻母咝П磉_(dá)會(huì)抑制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，而阻遏子可使宿主細(xì)胞免受這種影響。（11）應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便重點(diǎn)克隆外源基因區(qū)段，而不轉(zhuǎn)錄其它無(wú)關(guān)基因。（12）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)，即含有起始密碼AUG和SD序列，以便轉(zhuǎn)錄之后能夠順利于進(jìn)行翻譯。,（三）基因工程載體的種類,1、細(xì)菌質(zhì)粒 2、真核基因病毒DNA 3、噬菌體DN

9、A 4、單鏈DNA噬菌體M13載體 5、人工質(zhì)粒載體-科斯質(zhì)粒 6、酵母人工染色體 7、其他載體,1、細(xì)菌質(zhì)粒,（1）質(zhì)粒的定義 （2）質(zhì)粒的特性 （3）質(zhì)粒的分類 （4）質(zhì)粒載體的具備條件 （5）常用的細(xì)菌質(zhì)粒,（1）質(zhì)粒的定義,存在于天然細(xì)菌體內(nèi)的一種獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA，具有獨(dú)立復(fù)制的能力，常帶有細(xì)菌的抗藥基因。也存在于某些真核細(xì)胞（酵母的2環(huán)狀質(zhì)粒）,質(zhì)粒載體(plasmid),（2）質(zhì)粒的特性,獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的環(huán)狀DNA或RNA。 其遺傳特性屬于非染色體控制。 能夠進(jìn)行自我復(fù)制。 容易在宿主體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移和遷移。 可編碼宿主染色體所不具有的基因。能夠賦予宿主額外的

10、遺傳特性：A、編碼產(chǎn)生抗生素酶的抗性基因，B、編碼產(chǎn)生糖酵解酶系的基因，C、編碼產(chǎn)生抗重金屬酶的抗性基因。,質(zhì)粒的復(fù)制類型,嚴(yán)謹(jǐn)型（strigent plasmid)： 復(fù)制與宿主染色體同步受宿主染色體復(fù)制的限制，在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)低約份拷貝。,松弛型（relaxed plasmid): 復(fù)制不受宿主染色體復(fù)制的 限制可獨(dú)立復(fù)制，在宿主細(xì)胞中拷 貝數(shù)高，宿主細(xì)胞中質(zhì)粒有10-200拷貝?；蚬こ坛Ｓ幂d體。,質(zhì)粒DNA的構(gòu)型,三種不同的構(gòu)型： 當(dāng)其兩條核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)時(shí)，稱為共價(jià)閉合環(huán)形DNA(cccDNA)，這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構(gòu)型； 如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持

11、著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個(gè)缺口時(shí)，稱之為開(kāi)環(huán)DNA(ocDNA)； 若質(zhì)粒DNA的雙鏈均發(fā)生斷裂而形成線形分子，則通稱為L(zhǎng)構(gòu)型。,共價(jià)閉合環(huán)形DNA （SC型）,開(kāi)環(huán)DNA （oc型）,線性DNA （L型）,環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同構(gòu)型,（3）質(zhì)粒的分類,F質(zhì)粒-可使宿主A的部分基因隨著F質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)移到不存在該質(zhì)粒的另一宿主B的體內(nèi)。 R質(zhì)粒-可編碼宿主A的一種或者數(shù)種抗生素抗性基因，并能夠?qū)⑺鼈儙У讲淮嬖谠撡|(zhì)粒的另一宿主B的體內(nèi)，使得宿主B也獲得同樣的抗性。 Col質(zhì)粒-能編碼大腸桿菌毒素基因，通過(guò)表達(dá)之后產(chǎn)生的大腸桿菌毒素可以使得不帶Col質(zhì)粒的其它菌株死亡。,（

12、4）質(zhì)粒載體具備條件,質(zhì)粒載體，也稱質(zhì)粒克隆載體，是指用于實(shí)現(xiàn)基因工程操作的質(zhì)粒。必須具備以下條件： （1）其分子結(jié)構(gòu)中必須具有多個(gè)單一限制酶的切割位點(diǎn)。 （2）構(gòu)建重組質(zhì)粒之后必須具有轉(zhuǎn)化功能。 （3）分子量較小，易于操作。 （4）宿主范圍較為單一、無(wú)感染性。,（5）常用的細(xì)菌質(zhì)粒,pBR322pBH10pBH20 pTR262pAT153pXf3 Pmk16pGEM-3ZpUC19 A、pBR322質(zhì)粒 B、pUC19質(zhì)粒 C、pGEM-3Z 質(zhì)粒,A、 pBR322質(zhì)粒, 4363 bp 含一個(gè)復(fù)制點(diǎn) 含一個(gè)抗氨卞青霉素基因(ampR) 一個(gè)抗四環(huán)素基因 (tetR) ampR和tetR

13、抗性基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點(diǎn)，供外源基因插入 當(dāng)外源基因插入抗藥基因內(nèi)，抗藥基因失活。AmpRAmp敏感(AmpS )、TetRTet敏感(TetS).,pBR322:人工構(gòu)建重要質(zhì)粒,優(yōu)點(diǎn)：具有較小的分子量 具有兩種抗生素抗性基因，作為篩選標(biāo)記 具有高拷貝數(shù) 是松弛型質(zhì)粒,B、 pUC系列質(zhì)粒,由pBR322和M13噬菌體構(gòu)建而成的雙鏈質(zhì)粒載體； （1） 2674bp； （2） 有ampR和位于lacZ+ 基因中靠近5端多克隆位點(diǎn)(MCS)和來(lái)源于pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起始點(diǎn) （3）大腸桿菌-半乳糖苷酶(lacZ)的啟動(dòng)子及其編碼該基因氨基端-肽鏈的DNA序列,此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ+基

14、因，便于藍(lán)白篩選,pUC質(zhì)粒優(yōu)點(diǎn)： 具有更小的分子，更高的拷數(shù) 適于組織化學(xué)檢測(cè)重組體,C、 pGEM-3Z質(zhì)粒,含一個(gè)ampR基因和一個(gè)lacZ編碼基因; 有多克隆位點(diǎn)（MCS）; 正選擇顏色標(biāo)記 lacZ; 有兩個(gè)來(lái)自噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子PT7和PSP6,用于外源基因的高效表達(dá),注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3Z,PSP6,2、真核基因病毒DNA,（1）病毒載體的優(yōu)點(diǎn) （2）已經(jīng)研究的真核基因病毒DNA

15、,（1）病毒載體的優(yōu)點(diǎn),A、具有很高的拷貝數(shù)量。 B、有強(qiáng)大的啟動(dòng)子。 C、可保證目的基因的高效表達(dá)。,（2）已經(jīng)研究的真核基因病毒DNA,A、SV40病毒DNA B、牛乳頭瘤病毒 C、RNA病毒 D、昆蟲(chóng)桿狀病毒 E、人痘病毒DNA F、猴空泡病毒DNA G、人腺病毒DNA H、人牛痘病毒DNA I 、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,A、SV40病毒DNA,（A1）、 SV40病毒DNA的特性 （A2）、SV40病毒DNA的基因組 （A3）、SV40病毒DNA載體的構(gòu)建 （A4）、SV40病毒DNA載體的使用方法,（A1）、SV40病毒DNA的特性,為環(huán)狀雙螺旋結(jié)構(gòu)。其宿主為動(dòng)物細(xì)胞。 SV40病毒有二種表

16、達(dá)方式：（1）游離表達(dá)方式，SV40DNA+外源性DNA，形成重組DNA，進(jìn)入宿主體內(nèi)，以重組DNA的方式表達(dá)。（2）結(jié)合表達(dá)方式，重組DNA整合到宿主染色體的DNA之中，與染色體基因一起表達(dá)。,（A2）、SV40病毒DNA的基因組,（A3）、SV40病毒DNA載體的構(gòu)建,（A4）、SV40病毒DNA載體的使用方法,G、腺病毒,（G1）、腺病毒DNA載體 （G2）、腺病毒DNA載體的特點(diǎn),3、噬菌體DNA,（1） 噬菌體DNA的特性 （2） 噬菌體DNA的改造 （3） 噬菌體DNA的體外包裝 （4） 噬菌體載體的構(gòu)建 （5） 噬菌體載體的使用 （6） 噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn),（1）噬菌體DNA的特性

17、,噬菌體DNA為雙鏈的DNA病毒，宿主是大腸桿菌。 已發(fā)現(xiàn)噬菌體DNA可編碼61個(gè)基因。 A、噬菌體DNA在宿主體內(nèi)的生活方式 B、噬菌體DNA的結(jié)構(gòu),A、噬菌體DNA在宿主體內(nèi)的生活方式,（1）溶源方式：噬菌體DNA整合到大腸桿菌的DNA中，伴隨大腸桿菌DNA的復(fù)制而復(fù)制，這種方式是噬菌體DNA作為基因工程載體的理論依據(jù)。 （2）溶菌方式：噬菌體感染大腸桿菌后，終止了大腸桿菌染色體DNA所控制的遺傳信息表達(dá)，并進(jìn)一步分解大腸桿菌DNA，最后導(dǎo)致大腸桿菌完全溶解。,B、噬菌體DNA的結(jié)構(gòu),噬菌體基因組,基因組長(zhǎng)度：約為50kb的雙鏈DNA分子，實(shí)際大小為48502bp。 DNA是線狀雙鏈分子帶

18、有單鏈的互補(bǔ)末端，末端長(zhǎng)12個(gè)核苷酸，稱為粘性末端（cos序列）。當(dāng)噬菌體感染宿主細(xì)胞后，雙鏈DNA分子通過(guò)cos而成環(huán)狀。 61個(gè)基因，每個(gè)基因平均為1000bp，其中32個(gè)較為重要，它們的分布和排列與其功能有一定關(guān)系。 基因組分為二部分：（1）其中一半基因，控制著生命活動(dòng)周期。（2）另一半基因，可被外源性目的基因所取代， 而不影響噬菌體的生命活動(dòng)。,基因組分為幾個(gè)不連續(xù)的區(qū)域，三個(gè)片段組成：,（1）左臂，19.6kb，含噬菌體頭、尾蛋白質(zhì)編碼基因，AJ的12基因都是構(gòu)成外殼蛋白的基因。 （2）中央片段，12kb24kb，含PL控制red和gam基因。 （3）右臂，9kb11kb，含DNA復(fù)

19、制和溶菌有關(guān)蛋白編碼基因。與裂解有關(guān)的S和R基因、與DNA復(fù)制有關(guān)的O基因和P基因等分別聚集在一起。 噬菌體左右兩臂包含了復(fù)制和成熟所必須的全部機(jī)能蛋白編碼，而中央片段為非必需區(qū)，即位于J基因和N基因之間的片段可被其他大腸桿菌DNA片段所替換。,噬菌體基因組,非必需區(qū),（2）噬菌體DNA的改造,野生型噬菌體DNA分子較大，其結(jié)構(gòu)基因也很復(fù)雜，并且常常容納不下分子量更大的外源性目的基因DNA片段。需要對(duì)其進(jìn)行改造。 改造方法： （1）遺傳學(xué)方法-將噬菌體DNA交替地在不含質(zhì)粒的大腸桿菌、和含質(zhì)粒的大腸桿菌的宿主內(nèi)生長(zhǎng)，來(lái)刪去其過(guò)多的限制酶位點(diǎn)。 （2）體外刪除法-將噬菌體DNA在體外進(jìn)行限制酶消

20、化，再將未被切割部分經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)包裝后，去感染大腸桿菌。經(jīng)過(guò)幾代連續(xù)培養(yǎng)之后，噬菌體DNA就會(huì)失去不需要的限制酶位點(diǎn)。,（3）噬菌體DNA的體外包裝,A、體外包裝的作用 B、噬菌體DNA包裝的原理 C、噬菌體DNA的包裝過(guò)程,A、體外包裝的作用,噬菌體DNA連接上外源性目的基因，就成為重組DNA分子，但是，重組之后的DNA分子必須經(jīng)過(guò)包裝，加上蛋白質(zhì)外殼形成完整的病毒顆粒，才具有感染宿主的能力。,B、噬菌體DNA包裝的原理,噬菌體DNA的頭部蛋白+重組DNA分子+噬菌體DNA尾部蛋白，在適當(dāng)條件下混合，就能夠自動(dòng)地包裝成完整的噬菌體病毒顆粒。,（4）噬菌體載體的構(gòu)建,（A） 縮短長(zhǎng)度 （B） 改

21、造酶切位點(diǎn) （C） 增加選擇標(biāo)記,（A） 縮短長(zhǎng)度,插入型載體：,失去了非必需區(qū) 僅保留了EcoR的單一切點(diǎn) 切點(diǎn)又位于報(bào)告基因上，故在切開(kāi)DNA并插入外源基因后，報(bào)告基因失活，即可依此進(jìn)行重組體的篩選 可插入長(zhǎng)度為10kb的外源DNA,只含一個(gè)限制性位點(diǎn)可供插入外源DNA的載體，這類噬菌體載體稱插入型載體。,注意：噬菌載體作為載體，其重組噬菌體DNA大小只能： 37kb 51kb。,噬菌體載體是主要用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建，也經(jīng)常用于外源目的基因的克隆。,置換型載體,置換型載體：可被外源DNA置換的噬菌體非必需區(qū)兩側(cè)有一對(duì)限制性酶切位點(diǎn)的載體，稱為置換型載體。適用基因組克隆,特殊性質(zhì)：中間區(qū)域約

22、長(zhǎng)18kb，這一段DNA可以被外源置換而不會(huì)影響phage裂解生長(zhǎng)的能力。 包裝限制： phage頭部外殼蛋白容納DNA能力上限105%，下限75%。包裝范圍51kb, 36kb.只有DNA的長(zhǎng)度大于野生型phage DNA長(zhǎng)度的75而不超過(guò)其105時(shí)，才能被包裝成phage顆粒，當(dāng)DNA的長(zhǎng)度短于野生型的75%或超過(guò)105%時(shí)，phage活性就急劇下降，故要求載體DNA和外源DNA長(zhǎng)度之和在3651kb之間。 載體必要區(qū)是28kb,理論上克隆能力為23kb.,（B） 改造酶切位點(diǎn),野生型的-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1 - 2個(gè)。 為了

23、便于各種來(lái)源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)。,（C） 增加選擇標(biāo)記,加裝選擇標(biāo)記 lacZ,（5）噬菌體載體的使用,重組DNA的構(gòu)建 (酶切，連接） 噬菌體的體外包裝 噬菌體侵染大腸桿菌 重組DNA的分離,（6）噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn),容量大，裝載能力可達(dá)23kb，便于構(gòu)建基因文庫(kù) 重組子篩選較為方便 DNA提取操作較為簡(jiǎn)便,4：?jiǎn)捂淒NA噬菌體M13載體,M13噬菌體（M13 phage）是一種大腸桿菌雄性特異絲狀噬菌體，遺傳物質(zhì)是環(huán)狀單鏈DNA,全長(zhǎng)約6.5kb。宿主是絲狀大腸桿菌。它是單鏈DNA噬菌體中的一個(gè)典型的代表。M13感染細(xì)菌后，經(jīng)過(guò)復(fù)制轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈的復(fù)制型（RF）。復(fù)

24、制型M13可用作克隆載體。 噬菌體M13感染宿主之后，在含有異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的X-gal培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)形成藍(lán)色噬斑。通過(guò)藍(lán)色噬斑的出現(xiàn)可以顯示噬菌體M13的存在。 感染宿主之后，噬菌體M13所釋放的單鏈DNA可用于制作放射性標(biāo)記探針，用來(lái)檢測(cè)RNA的結(jié)構(gòu)。,M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu),M13噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂。,M13噬菌體的外型呈絲狀,M13 噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成,M13 DNA全長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸,M13 DNA上至少有11個(gè)基因,2700個(gè)外殼蛋白

25、分子,M13 噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng),M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu),單鏈DNA，由6407堿基組成。 90%以上的序列可編碼蛋白質(zhì)，共有11個(gè)編碼基因 基因間的間隔區(qū)多為幾個(gè)堿基。較大的間隔位于基因/以及基因/之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達(dá)和DNA合成的元件。,M13噬菌體的基因組,M13噬菌體的基因組,編碼3類蛋白質(zhì)： 復(fù)制蛋白（基因，和） 形態(tài)發(fā)生蛋白（基因，和） 結(jié)構(gòu)蛋白（基因、和）,M13噬菌體載體的構(gòu)建,M13噬菌體作為載體的重要特點(diǎn)： M13噬菌體的感染與釋放不會(huì)殺死宿主菌，僅導(dǎo)致宿主菌生長(zhǎng)緩慢； M13噬菌體DNA在宿主菌內(nèi)既可以是單鏈也可以是雙鏈，通過(guò)感染或轉(zhuǎn)化的方法能將M1

26、3噬菌體DNA導(dǎo)人宿主菌中； M13噬菌體的包裝不受DNA大小的限制，其噬菌體顆粒的大小可隨DNA的大小而改變，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能進(jìn)行包裝。,M13噬菌體在用作載體時(shí)是利用其雙鏈狀態(tài)的RF DNA：?jiǎn)捂淒NA的酶切和連接是比較困難的。 外源片段插入位點(diǎn)在基因和基因之間的508bp間隔區(qū)-M13不像噬菌體基因組那樣含有較大的可替代區(qū)。它的基因組中絕大多數(shù)為必需基因，只有兩個(gè)間隔區(qū)可用來(lái)插入外源DNA（基因/和基因/之間）。,5：人工質(zhì)粒載體-科斯質(zhì)粒,1978年Collins和Hohn構(gòu)建一種新型的大腸桿菌克隆載體，命名為cosmid(柯斯質(zhì)粒)，又叫粘粒。 柯斯質(zhì)粒（cosmid）= cos序列+質(zhì)粒。 實(shí)際是質(zhì)粒的衍生物，它是用正常的質(zhì)粒同噬菌體的cos位點(diǎn)構(gòu)成。 A、科斯質(zhì)粒的基本組成 B、科斯質(zhì)粒的特性 C、科斯質(zhì)粒的用途,Cos質(zhì)粒（考斯質(zhì)粒 Cosmid）,A、科斯質(zhì)粒的基本組成,（1）含有噬菌體DNA的粘性末端序列（COS序列）。 （2）含有質(zhì)粒的一個(gè)復(fù)制起始區(qū)。 （3）含有質(zhì)粒的一個(gè)抗藥性標(biāo)記。 （4）具有多種限制性內(nèi)切酶的單一性切點(diǎn)。,柯斯質(zhì)粒pHC79系,由質(zhì)粒pBR322和噬菌體的cos位點(diǎn)的一段DNA構(gòu)成。 包裝時(shí)，cos位點(diǎn)打開(kāi)而產(chǎn)生噬菌體的粘性末端。由于pHC79有pBR322DNA，所以也就有氨芐青霉素抗性和四環(huán)素抗