1、植物組織培養(yǎng)技術(shù),Plant Tissue Culture,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、相關(guān)知識(shí) 三、實(shí)驗(yàn)原理 四、試劑和器材 五、操作步驟 六、思考題,目 錄,2020/8/26,3,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握植物組織培養(yǎng)相關(guān)理論知識(shí) 掌握植物組織培養(yǎng)的操作方法 了解不同激素及其比例對(duì)愈傷組織再分化的作用,2020/8/26,4,二、相關(guān)知識(shí),離體（in vitro)條件下利用人工培養(yǎng)條件在無菌情況下培養(yǎng)、生長、發(fā)育再生出完整植株的過程。 1958年，英國科學(xué)家Steward 等用胡蘿卜根的愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出胚狀體并分化為完整的小植株，不但使細(xì)胞全能性理論得到證實(shí)，而且為組織培養(yǎng)的技術(shù)程序奠

2、定了基礎(chǔ)。,2020/8/26,5,應(yīng)用領(lǐng)域 1、快速繁殖 運(yùn)用組織培養(yǎng)的途徑，一個(gè)單株一年可以繁殖幾萬到幾百萬個(gè)植株。例如一株蘭花一年繁殖到400萬株。 2、種苗脫毒 針對(duì)病毒對(duì)農(nóng)作物造成的嚴(yán)重危害，通過組織培養(yǎng)可以有效地培育出大量的無病毒種苗。 3、遠(yuǎn)緣雜交 利用組織培養(yǎng)可以使難度很大的遠(yuǎn)緣雜交取得成功，從而育成一些罕見的新物種。,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,6,應(yīng)用領(lǐng)域 4、突變育種 采用組織培養(yǎng)可以直接誘變和篩選出具抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白等優(yōu)良性狀的品種。 5、基因工程 基因工程主要研究DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后必須通過組織培養(yǎng)途徑才能實(shí)現(xiàn)植株再生。 6、生物制品 有些極其

3、昂貴的生物制品，如抗癌首選藥物-紫杉醇等，可通過組織培養(yǎng)方式生產(chǎn)。,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,7,植物組織培養(yǎng)的分類 廣義的組織培養(yǎng)依外植體不同，可分為： 1) 器官培養(yǎng)（organ culture） 2)莖尖分生組織培養(yǎng)(shoot tip culture, apical meristem culture) 3)愈傷組織培養(yǎng)(calluse cultrue) 4)細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture) 5)原生質(zhì)體培養(yǎng)(protoplast culture),二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,8,外植體(explant)：由活體（in vivo)植物體上提取下來的，接種在培養(yǎng)基上的無菌

4、細(xì)胞、組織、器官等。 愈傷組織(callus)：在人工培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團(tuán)無序生長狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,9,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,10,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,11,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,12,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,13,二、相關(guān)知識(shí),二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,15,植物組織培養(yǎng)特點(diǎn) 培養(yǎng)條件可以人為控制 生長周期短，繁殖率高 管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,16,植物組織培養(yǎng)營養(yǎng)條件-培養(yǎng)基(Culture Medium) 培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。 培養(yǎng)

5、基的成分主要可以分水、無機(jī)鹽、有機(jī)物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,17,國際上流行的培養(yǎng)基有幾十種，常用的培養(yǎng)基有： MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、KM-8P培養(yǎng)基,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,18,常用培養(yǎng)基簡(jiǎn)介-MS培養(yǎng)基 1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)是無機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。,二、相關(guān)

6、知識(shí),2020/8/26,19,常用培養(yǎng)基簡(jiǎn)介-B5培養(yǎng)基 是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。其主要特點(diǎn)是含有較低的銨，這可能對(duì)不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實(shí)踐得知有些植物在B5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,20,常用培養(yǎng)基簡(jiǎn)介-White培養(yǎng)基 是1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基，提高了MgSO4的濃度和增加了硼素。其特點(diǎn)是無機(jī)機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,21,常用培養(yǎng)基簡(jiǎn)介N6培養(yǎng)基 是1974年朱至清等為水稻等禾谷

7、類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是成分較簡(jiǎn)單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,22,常用培養(yǎng)基簡(jiǎn)介KM-8P培養(yǎng)基 1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)是無機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,23,不同營養(yǎng)條件對(duì)植物組織培養(yǎng)的影響,Growth med

8、ium is optimised for regeneration of plantlets,No sucrose (0%),Sucrose reduced to 1%,Sucrose increased to 5%,The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface,Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.,Shoots developed on e

9、dges of upper surface, and some root development has occured,Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium,二、相關(guān)知識(shí),No BAP,BAP reduced to 0.1 mg. l-1,No NAA,Poor shoot development and no roots. Extensive

10、 callus generation,Poor shoot development and no roots,NAA reduced to 0.1 mg. l-1,More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developi

11、ng at the edges of the explant,二、相關(guān)知識(shí),NAA increased to 5.0 mg. l-1 Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus,No MS salts No sign of regeneration from explant at all.,MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of s

12、hoots,MS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.,二、相關(guān)知識(shí),2020/8/26,26,植物細(xì)胞的全能性,植物細(xì)胞具有該植物體全部遺傳的可能性，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。 差異:(1) 受精卵的全能性最高 (2) 受精卵分化后的細(xì)胞中，體細(xì)胞的全能性比生殖細(xì)胞的低。 潛在全能性的原因：基因表達(dá)的選擇性 科學(xué)研究表明，處于離體狀態(tài)的植物活細(xì)胞，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完

13、整的植株。人工條件下實(shí)現(xiàn)的這一過程，就是植物組織培養(yǎng)。,三、實(shí)驗(yàn)原理,2020/8/26,27,植物細(xì)胞全能性的表達(dá),脫分化（dedifferentiation)：將來自已分化組織的已停止分裂的細(xì)胞從植物體部分的抑制性影響下解脫出來，恢復(fù)細(xì)胞的分裂活性。 再分化（redifferentiation):經(jīng)脫分化的組織或細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下可有轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同細(xì)胞類型的能力。,三、實(shí)驗(yàn)原理,2020/8/26,28,四、試劑和器材,1、材料 新鮮胡蘿卜莖 2、試劑 MS培養(yǎng)基 10%亞硫酸溶液,2020/8/26,29,MS培養(yǎng)基配制方法,四、試劑和器材,2020/8/26,30,四、試劑和器材,

14、3、儀器 高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、烘箱、培養(yǎng)箱 4、玻璃器皿 試劑瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、 刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培養(yǎng)皿 5、用具 鑷子、解剖刀、接種針、記號(hào)筆、封口膜,2020/8/26,31,離體的植物器官、組織、細(xì)胞,脫分化,愈傷組織,再分化,根 芽,植物體,五、操作步驟,切開胡蘿卜，在圓圈處取一塊組織 P-木質(zhì)部、C-形成層、X-韌皮部,五、操作步驟,形成層開始形成愈傷組織 C1-愈傷組織、C2-形成層,五、操作步驟,3-4周后完全形成愈傷組織狀態(tài)（脫分化） 組織塊失去色素,五、操作步驟,把脫分化后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上,五、操作步驟,

15、兩周左右開始再分化，長出幼苗,五、操作步驟,將幼苗移植到外部條件下培養(yǎng)（順化）,五、操作步驟,順化一個(gè)月后的胡蘿卜植株,五、操作步驟,培養(yǎng)基配制(I)母液配制：,按照MS培養(yǎng)基成分表, 配制分別配制培養(yǎng)基的母液。 1、大量元素母液(10倍液) 分別稱取10倍用量的各種大量無機(jī)鹽，依次溶解于大約800ml熱的（60-80）蒸餾水中。（一種成分完全溶解后再加入下一種，最后加水，定容至1000ml后裝入試劑瓶中，冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆茫?五、操作步驟,2、微量元素母液(100倍液) 分別稱取100倍用量的微量無機(jī)鹽，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定溶到1000ml。 3、鐵鹽母液（100倍液） 稱取1

16、00倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸鈉)和FeSO47H2O，溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。,五、操作步驟,培養(yǎng)基配制(I )母液配制：,4、有機(jī)物質(zhì)母液(100倍數(shù)) 分別稱取50倍用量的各種有機(jī)物質(zhì)，依次溶解于400ml重蒸水中，定容至1000ml，裝入棕色試劑瓶中，貯存冰箱備用。 除上述四種母液外，培養(yǎng)基中經(jīng)常附加的各種生物素和細(xì)胞分裂素也要配成母液貯存，臨用時(shí)按濃度定量吸取加入。,五、操作步驟,培養(yǎng)基配制(I)母液配制：,5、生長素 如2,4-D、IAA、NAA等。準(zhǔn)確稱取20mg，先用2ml95%乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，濃度為1mg/ml，再放置冰

17、箱內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?6、細(xì)胞分裂素 如激動(dòng)素(Kt)、6-芐基嘌呤(6-BA)。準(zhǔn)確稱取20mg，先用2ml的1mol/ml HCL或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，濃度為1mg/ml，再放置冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?五、操作步驟,培養(yǎng)基配制(I)母液配制：,取1000ml燒杯一只，加大量元素10倍母液100ml，微量元素100倍母液10ml，鐵鹽100倍母液10ml,有機(jī)物質(zhì)100倍母液10ml。此外,根據(jù)培養(yǎng)材料和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪€要附加一定量的生長素,細(xì)胞分裂素及蔗糖等,然后加水至1000ml,待蔗糖充分溶解后用1mol/L 的NaOH或HCl調(diào)酸堿度為pH5.8,最后加入瓊脂粉6.5g,如用瓊脂條

18、,則要加8g。,五、操作步驟,培養(yǎng)基配制(II)配制與分裝：,將盛有培養(yǎng)基的燒杯在電磁爐上，煮至瓊脂完全融化，補(bǔ)加蒸餾水至1000ml。 將配制好的培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)用三角瓶中，每只100ml三角瓶約裝40ml培養(yǎng)基。 分裝時(shí)要避免把培養(yǎng)基倒在瓶口上，否則培養(yǎng)時(shí)容易引起雜菌污染。,五、操作步驟,培養(yǎng)基配制(II)配制與分裝：,1、把裝好的培養(yǎng)基的三角瓶放入高壓滅菌鍋中，蓋好鍋蓋。 2、設(shè)置滅菌參數(shù)為121，20min，開始滅菌。,五、操作步驟,培養(yǎng)基配制(III)滅菌：,1、取新鮮胡蘿卜莖，用去離子水洗凈。 2、在胡蘿卜莖上切一塊含有形成層的組織，放入磨口三角瓶中，倒入適量10%亞硫酸溶液，輕輕搖動(dòng)15-30s。 3、倒去亞硫酸溶液，無菌水洗滌3-4次，徹底清除殘留葉面和瓶?jī)?nèi)的亞硫酸溶液,五、操作步驟,胡蘿卜的取材與處理,1、先用肥皂洗手，穿上工作服，戴上口罩和工作帽。 2、放入培養(yǎng)瓶和滅菌后的接種用具(鑷子、解剖刀、接種針)，把鑷子、解剖刀、接種針插入內(nèi)盛70%酒精的廣口瓶中。 3、用鑷子把胡蘿卜夾入培養(yǎng)皿內(nèi)的吸水紙上，吸干水珠，把胡蘿卜切成含有“木質(zhì)部”