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文檔簡介

1、RNA提取,高級生化與分子生物學研究技術,目 錄,1、試劑介紹 2、主要提取流程 3、詳細步驟 4、注意事項,1、試劑介紹,本實驗室提取RNA常用的抽提劑是全式金Trizol。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質，能迅速破碎細胞并抑制細胞釋放出的核酸酶。Trizol在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性，因此對純化RNA及標準化RNA的生產十分有用。,2、主要提取流程,磨 樣,加氯仿,轉移水相,加乙醇,室溫晾干,保 存,溶解RNA,測濃度,膠狀物,加 Trizol,去雜質,1、剪取新鮮幼嫩葉片，置于液氮中慢慢反復研磨，直至其成

2、為合格粉末為止。 2、加入1ml Trizol，晃動3-5下，再用槍吹打2-3下，確保全部裂解。 3、室溫放置5分鐘，使樣品充分裂解。 12,000g、 4離心10分鐘。 4、每毫升 Trizol加入0.2ml氯仿，猛烈晃動15秒，室溫放置2-3分鐘。 5、12,000g 4離心15分鐘，然后吸取上層無色水相至一新的離心管中。,3、詳細步驟,6、按1ml最初的Trizol加入0.5ml異丙醇，顛倒數次混勻，室溫沉淀10分鐘。 7、12,000g、 4離心10分鐘，棄上清，在管底可見RNA沉淀（透明膠狀）。 8、每毫升最初的Trizol加入1ml 75%乙醇（DEPC水配制），劇烈震蕩。 9、

3、7,500g 、4離心5分鐘，棄上清。再用離心機甩一下（5,000rpm, 離心1分鐘），小心吸盡液體。 10、待RNA略干后，加入20l DEPC水溶解，-80凍存。,4、注意事項,1、所有離心管，槍頭及相關溶液都必須無RNA酶污染。耐高溫器物可放置于150烘烤4小時以去除RNA酶，其它器物去除RNA酶可考慮用0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。 2、必須戴一次性口罩和一次性手套操作。盡量不要對著RNA樣品呼氣或說話，以防RNA酶污染。 3、提取RNA整個過程中，盡量在低溫下操作。,4、在操作中當加入變性劑氯仿后，須劇烈震蕩，這樣才能徹底使兩相混勻。 5、在提取核酸時，如樣品濃度低，則應增加有機溶劑沉淀時間，80下30min

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