1、第五章 分子熒光分析法,第一節(jié) 基本原理 第二節(jié) 儀器 第三節(jié) 定性定量分析 第四節(jié) 熒光新技術(shù)和應(yīng)用實(shí)例,第一節(jié) 基本原理,一、分子熒光的發(fā)生過(guò)程 分子的激發(fā)態(tài) 熒光的產(chǎn)生 激發(fā)光譜和熒光光譜 激發(fā)光譜和熒光光譜的關(guān)系 二、分子結(jié)構(gòu)與熒光關(guān)系 熒光效率 分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系 影響熒光強(qiáng)度的外界因素 熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系,第五章 分子熒光分析法,第五章 分子熒光分析法 (Molecular Fluorescence spectrophotometry) 概述 1.熒光：當(dāng)分子吸收一定能量后，躍遷至激發(fā)態(tài)。由 第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)各振 動(dòng)能級(jí)，以光的形式放出能量，產(chǎn)生熒光

2、。 2.熒光分析法：通過(guò)測(cè)定所發(fā)射熒光的特性和強(qiáng)度， 對(duì)物質(zhì)定性、定量分析的方法。 3.熒光分析法的優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，最低檢測(cè)濃度可達(dá) 10-710-9g/ml，選擇性好，需樣量少，方法簡(jiǎn) 便。,第五章 分子熒光分析法,第一節(jié) 基本原理 一、分子熒光的發(fā)生過(guò)程 1.分子的激發(fā)態(tài) （1）去活化過(guò)程：當(dāng)分子吸收一定能量后，處于激 發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，其電子以輻射躍遷或無(wú)輻射 躍遷釋放出多余的能量回到基態(tài)，這個(gè)過(guò)程為分 子去活化過(guò)程。 （2）單線態(tài)：分子受輻射激發(fā)時(shí)，電子從最高占有 軌道躍遷到較高空軌道，受激電子自旋仍保持方 向相反，稱(chēng)激發(fā)單線態(tài)。 （3）三線態(tài)：受激電子自旋方向反轉(zhuǎn)，電子自旋為 平行時(shí)

3、是激發(fā)三線態(tài)。,2熒光的產(chǎn)生：分子躍遷到較高能級(jí)后，以無(wú)輻射 躍遷的形式下降到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng) 能級(jí)，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)各振動(dòng)能 級(jí)，這種光稱(chēng)為熒光。 3激發(fā)光譜和熒光光譜：是定性和定量分析的基礎(chǔ) （1）激發(fā)光譜：固定入熒以激為橫坐標(biāo)，E熒縱坐 標(biāo)作圖E熒-激 （2）熒光光譜：固定入激以熒為橫坐標(biāo)，E熒縱坐 標(biāo)作圖E熒-熒,第五章 分子熒光分析法,4激發(fā)光譜和熒光光譜的關(guān)系： （1）熒光發(fā)射光譜不隨激發(fā)波長(zhǎng)而改變。只強(qiáng)度改 變。因此熒光光譜只有一個(gè)譜帶。 （2）激發(fā)光譜和熒光光譜呈現(xiàn)鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系。,第五章 分子熒光分析法,二、分子結(jié)構(gòu)與

4、熒光關(guān)系 1.熒光效率 能發(fā)射熒光物質(zhì)條件： 物質(zhì)分子在紫外-可見(jiàn)光區(qū)有較強(qiáng)吸收的特定結(jié)構(gòu)。 分子必須有較高的熒光效率。 f=發(fā)射熒光的量子數(shù)/吸收激發(fā)光的量子數(shù),第五章 分子熒光分析法,2.分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系 （1）共軛雙鍵結(jié)構(gòu)：芳環(huán)雜環(huán)化合物，含共軛雙鍵 脂肪烴-激 （2）分子的剛性平面：效應(yīng)增加，可使熒光效率增 大。 （3）取代基效應(yīng)： 給電子基：熒光效率提高。 吸電子基：熒光減弱熄滅。 對(duì)電子共軛體系作用小，對(duì)F無(wú)影響。,第五章 分子熒光分析法,3.影響熒光強(qiáng)度的外界因素 （1）溫度：溫度升高，碰撞增多，熒光效率降低。 （2）溶劑：不同溶劑中熒光光譜和熒光強(qiáng)度會(huì)有顯 著變化。溶劑極性

5、增加，熒光強(qiáng)度增大。 雜質(zhì)可使熒光增強(qiáng)或減少。 （3）pH值：熒光物質(zhì)為弱酸或弱堿，不同pH值，平 衡改變，使分子型體和離子型體的濃度及 比例不同，熒光強(qiáng)度有差異。 （4）散射光：因碰撞使運(yùn)動(dòng)方向改變而向不同角度 散射的光為散射光。 瑞利散射光只方向改變而波長(zhǎng)不變的散射光。 萊曼散射光是方向和量都改變的散射光。,第五章 分子熒光分析法,（5）熒光熄滅的影響 熒光熄滅：熒光物質(zhì)，溶劑，溶質(zhì)分子間相互作用 使熒光強(qiáng)度降低或與濃度不呈線性關(guān)系的現(xiàn)象 為熒光熄滅。 1）熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)。 2）熒光熄滅產(chǎn)生原因： 熒光物質(zhì)與熄滅劑碰撞，能量損失。 兩者作用生成不發(fā)光的配合物。 向熒光物質(zhì)中

6、加入溴或碘后易發(fā)生無(wú)輻射去活 化過(guò)程。 熒光物質(zhì)超過(guò)1g/L時(shí)，發(fā)生自吸收或聚合。 有溶解氧存在已發(fā)生氧化或促進(jìn)無(wú)輻射去活化 過(guò)程。,第五章 分子熒光分析法,4熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系 （1）熒光方向：熒光可在各方向觀察到，因激發(fā) 光可部分透過(guò)溶液，為減小干擾，在與透射 垂直方向觀測(cè)。 （2）選兩個(gè)不同波長(zhǎng)光：激、熒 （3）定量關(guān)系： F=KC (abc0.05) 定量分析基礎(chǔ),第五章 分子熒光分析法,第二節(jié) 儀器 一、儀器的主要部件 構(gòu)造：激發(fā)光源單色器樣品池單色 器檢測(cè)器等四部分 1.激發(fā)光源：能發(fā)出強(qiáng)度較大，連續(xù)穩(wěn)定的光 源。 主要有：溴鎢燈、氫燈、高壓汞燈、氙弧燈 2.分光系統(tǒng)：

7、第一單色器（激發(fā)單色器）：位于光源與液槽 間，濾去非選擇波長(zhǎng)的激發(fā)光。 第二單色器（發(fā)射單色器）：位于液槽與檢測(cè)器 之間，濾去反色光，散色光和雜質(zhì)產(chǎn)生的熒 光。,第五章 分子熒光分析法,3.樣品池：石英材質(zhì)，四面透光。玻璃吸收323nm 以下紫外光。 4.檢測(cè)器：熒光弱，檢測(cè)器靈敏度要高。 光二極管陣列檢測(cè)器。 二、儀器的類(lèi)型 1.光電熒光計(jì)：濾光片熒光計(jì)。 溴鎢燈，濾光片，光電管。 2.熒光分光光度計(jì)：氙燈，光柵，狹縫， 光電倍增管。,第五章 分子熒光分析法,第三節(jié) 定性定量分析 一、定性分析 由兩個(gè)特征光譜（熒光光譜，激發(fā)光譜）定性，可靠性強(qiáng)。但一定有標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照。 二、定量分析方法 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線法： 2、直接比較法，空白熒光為F0時(shí)， Cs/Cx=(Fs-F0)/(Fx-F0),第五章 分子熒光分析法,第四節(jié) 光新技術(shù)和應(yīng)用實(shí)例 一、新技術(shù) 1.激光熒光分析：用波長(zhǎng)更長(zhǎng)，強(qiáng)度更大的激光作光源，提 高熒光法的靈敏度和專(zhuān)一性?？蓞f(xié)調(diào)激光 器作光源，熒光單色器省略。 2.同步熒光分析：激發(fā)光譜和熒光光譜中選擇