1、細胞培養(yǎng)細節(jié),實驗室布局 實驗室設(shè)備 培養(yǎng)用品的清洗和消毒滅菌 無菌操作中的注意事項 細胞培養(yǎng)常用液體 細胞的原代和傳代培養(yǎng)： 原代細胞培養(yǎng)原理 原代細胞培養(yǎng)操作 傳代細胞培養(yǎng)原理 細胞傳代方法 細胞計數(shù) 細胞活力測定 細胞凍存與復(fù)蘇 寄送細胞的處理 培養(yǎng)細胞的觀察 細胞培養(yǎng)的污染和檢測,內(nèi) 容,實驗室布局,一、無菌操作室 要求：房間清潔無塵，紫外線空氣消毒、層流； 可放置培養(yǎng)箱、小冰箱、顯微鏡、無菌物品等； 超凈工作臺：無菌操作、細胞培養(yǎng),生物安全級別的選擇,垂直流超凈工作臺,工作原理：利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣通過高效濾器除去空氣中的細菌、塵埃顆粒，使空氣得到凈化。,該設(shè)備能夠使超凈臺中的物品、標(biāo)

2、本、試劑等保持無菌狀態(tài)，但由于空氣流向操作者，只適合進行一般的細胞培養(yǎng)，不適于致病性微生物培養(yǎng)。,生物安全柜,一種既能使操作造成無菌、無塵的局部空氣環(huán)境，保證檢驗、檢測不受污染，又能保證被研究的對象（如病菌、細菌等）不外，保護周圍環(huán)境及操作人員的安全隔離設(shè)備。 該設(shè)備可廣泛應(yīng)用于低、中等危險度（病原體1-3，DNA重組P1-P3）的臨床細菌學(xué)，病毒學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、生物學(xué)等,二、緩沖間 要求：房間清潔無塵，有紫外線可以進行空氣消毒 可放置培養(yǎng)箱、冰箱、離心機、顯微鏡等小型儀器,三、更衣間 要求：房間清潔無塵，有鞋柜、衣柜 更換衣、帽、鞋、口罩,四、準(zhǔn)備區(qū) 要求：可集中在一個區(qū)域，也可分散

3、分布，應(yīng)包括培養(yǎng)用液的配制，如天平、酸度計等；細胞物品存放，如冰箱、液氮罐等；清洗和消毒滅菌，如酸缸、大水池、干燥箱、消毒器、蒸餾水器等相關(guān)物品,細胞培養(yǎng)實驗室的設(shè)備 基本設(shè)備, 儀器 顯微鏡倒置、普通、解剖、照像系統(tǒng) 培養(yǎng)箱恒溫（370.5 )；5% CO2 ； 恒濕（含無菌蒸餾水的水槽） 干燥箱烘干（37-60 ）、消毒（160 ） 水純化裝置雙或三蒸餾水器、離子交換 冰箱4 （培養(yǎng)液等）、-20 （酶、血清） 液氮罐儲存、運輸 離心機普通、低溫水平離心機 天平普通、電子 消毒器高壓蒸汽消毒器（小、電熱） 濾器液體過濾；正壓或負壓, 培養(yǎng)用器皿 要求透明、無毒（中性硬質(zhì)玻璃、塑料） 形式培

4、養(yǎng)瓶、皿、培養(yǎng)板 操作用器皿玻璃瓶、吸管、加樣器、離心管、 試管架、鋁或不銹鋼盒、吸頭、 蓋子、凍存管、注射器、燒杯、 量筒、漏斗等 器械手術(shù)刀、鉗、剪（?。㈣嚕ㄐ。┑?酶聯(lián)免疫檢測儀免疫學(xué)、細胞毒性、 藥物敏感性測定 超低溫冰箱 -70oC以下 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器特殊、大量細胞培養(yǎng) 熒光顯微鏡熒光染色觀察,細胞培養(yǎng)實驗室的設(shè)備 特殊設(shè)備,清洗,在組織細胞培養(yǎng)中，體外細胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細胞的生長 微生物產(chǎn)品附帶雜物 上次細胞殘留物 非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì) 需要清洗的培養(yǎng)用品 玻璃器皿的清洗 膠塞的清洗 塑料制品的清洗,培養(yǎng)用品的清洗和消毒滅菌,消毒滅菌,物理消毒滅菌法 紫外線：

5、用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒的培養(yǎng)器皿，30min 濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121，20min 干烤：160, 2 小時 過濾：0.22m 化學(xué)消毒滅菌法 70%酒精 主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理 1新潔爾滅 主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒 抗生素 主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染,器皿的清消,一、新的玻璃器皿的洗消：,1、自來水刷洗，除去灰塵。 2、烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。 3、刷洗、烘干：12小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。 4、泡酸、清洗：用

6、清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來水沖洗15次，最后蒸餾水沖洗3-5次和用雙蒸水過3次。 5、烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙包裝。 6、高壓消毒：15磅，維持20-30分鐘。 7、高壓消毒后烘干：因為高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用,二、舊的玻璃器皿的洗消：,1、刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入洗滌劑溶液中，清水刷洗干凈，然后烘干。 2、泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液，12小時后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次。 3、烘干、包裝：洗

7、干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙包裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。 4、高壓消毒：15磅，20-30分鐘。（玻璃培養(yǎng)瓶消毒前可將瓶塞輕輕蓋上） 5、烘干備用,三、金屬器械洗消：,金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75酒精擦拭，再用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15磅高壓（30分鐘）消毒，再烘干備用。,四、橡膠和塑料：,橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進行如下的處理程序：,1、針式濾器帽不能泡酸液,用2% NaOH 或洗衣粉泡6-12小時,或者煮沸20分鐘

8、,在包裝之前要裝好濾膜，安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi)15磅20-30分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺內(nèi)取出使用時應(yīng)該立即將螺旋旋緊。,2、膠塞烘干后用2氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。 3、膠帽，離心管帽烘干后只能在2氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時（切記時間不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入5%鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。 4、膠頭可

9、用75酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。 5、一次性無菌塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管等不需處理。,五、其他消毒方法： 有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用75酒精浸泡；塑料培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿：打開蓋子，放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下消毒。,六、注意事項： 1、嚴(yán)格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓消毒時，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸餾水，以防高壓時燒干，水不能過多因為其將使空氣流暢受阻，會降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時爆炸。 2、安裝濾膜時注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾的作用。 3、泡酸時要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。 4、從酸缸內(nèi)撈取器皿時防

10、止酸液濺到地面，會腐蝕地面。 5、器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。,清潔液的配制 清潔液配方 重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml） 強清潔液 631000200 次強清洗液 120 2001000 弱清潔液 100 1001000 配制時應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分 配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)。配成后清潔液一般為棕紅色。,水,水的制備： 細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。 需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或超純水,細胞培養(yǎng)常用液體,細胞培養(yǎng)基,市場上可提供干粉培

11、養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基 干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌，其優(yōu)點是價格便宜。缺點是配制過程繁瑣，質(zhì)量不易控制 液體培養(yǎng)基是由專業(yè)廠家按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)?；a(chǎn)，不僅質(zhì)量得到保證，而且使用十分方便 常用的培養(yǎng)基種類 RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、M199、F10等,細胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇,選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點建議可供參考： (1）建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I，或在購買細胞株時咨詢。 (2) 其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細胞。 (3) 根據(jù)細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如淋巴

12、細胞多選 RPMI1640 。 (4) 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。,配制舉例：制備1000mlRPMI1640培養(yǎng)基,RPMI1640干粉培養(yǎng)基10.4g（1包）， 丙酮酸鈉 0.11g, 碳酸氫鈉 2g， b-巰基乙醇 3.7mm(淋巴細胞培養(yǎng)需要）， HEPES 5.925g（可以不加）, 蒸餾水800ml 攪拌至完全溶解，調(diào)PH = 7.2 加三蒸餾水定容至1000ml 在超凈臺內(nèi)無菌條件下，用滅菌后的并置有0.22m孔徑濾膜的過濾器除菌，4保存?zhèn)溆?血清,種類：胎牛、新生牛、

13、小牛、馬、人血清 熱滅活：56, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清 熱滅活目的：滅活血清中的補體成分。 血清中的沉淀物 絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量。可用離心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理 顯微鏡下“小黑點”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號的血清,平衡鹽液體,組織細胞培養(yǎng)中常用的基本液體，可以維持滲透壓、調(diào)節(jié)pH值、供給細胞生存所需的能量和無機離子成分 用于洗滌組織、

14、細胞等 可以過濾除菌，也可高壓滅菌,PBS（Phosphate-Buffered Sallines）,DPBS（Dulbeccos Phosphate-Buffered Sallines）標(biāo)準(zhǔn)型,D-Hanks 平衡鹽溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS),消化液,分離組織和分散細胞 常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液 單獨或混合使用 過濾除菌,胰蛋白酶溶液,主要作用：使細胞間的蛋白質(zhì)水解，使細胞相互離散 消化細胞時，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用,稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks 平衡鹽溶液調(diào)成糊

15、狀，再補足D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4 小時或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩 次日，先用濾紙粗濾，再進行過濾除菌，分裝入瓶中， -20保存?zhèn)溆茫ㄒ悦夥纸馐В?，常用濃度?.25% （0.1%-0.5%） 胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 至7.2 左右,胰蛋白酶溶液配制,谷氨酰胺補充液,谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加 配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養(yǎng)液內(nèi) 使用終濃度為1-4

16、mmol/L 一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制方法為 ： 谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫30），過濾除菌，分裝小瓶，-20保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入0.5-2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mmol/L,酚紅,大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH 指示 紅色表示中性pH，黃色代表酸性pH，紫色表示堿性pH 在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅 因為已有一些研究表明：酚紅能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用,抗生素溶液,抗生素使用種類與濃度： 工作濃度 儲存溫度 殺滅細菌 penic

17、illin 100 u/ml -20 G(+) streptomycin 100 ug/ml -20 G(+) 、G(-) gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) 、G(-)、支原體amphotericin B 2.5 ug/ml -20 真菌nystatin 50 ug/ml -20 真菌,用無菌雙蒸水配制即可，或直接按工作濃度加入培養(yǎng)液中，與培養(yǎng)液一起過濾,細胞培養(yǎng)用液體配制中的滅菌和除菌,過濾除菌：0.22mm，幾乎適合所有液體 少量液體（幾幾十毫升）：小濾器 大量液體（幾百幾千毫升）：大濾器 高壓滅菌：適合耐高溫的液體，如水、PBS等 少量試劑配制： 購買時即為無菌試

18、劑，在超凈臺內(nèi)，用無菌相關(guān)液體配制即可； 有菌試劑：如為昂貴試劑，建議用進口的一次性小濾器過濾。 特殊試劑，如DMSO，本身即為無菌狀態(tài)，無需滅菌。若要過濾，則須使用耐DMSO的Nylon 材質(zhì)濾膜。,效果檢測：無菌試驗 在超凈臺內(nèi)，取少量液體，加入5-10%無菌血清，置無菌容器（如培養(yǎng)瓶），37 放置48小時，如液體清亮、不變黃，則為無菌。,無菌操作中的注意事項,1、操作前 操作前無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以75 % 酒精擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10 分鐘 實驗人員的無菌準(zhǔn)備：1、肥皂洗手；2、穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、換好拖鞋；3、用75酒精

19、棉球擦凈雙手。,2、操作中 操作時，小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗； 容器打開后，傾斜約45角取用； 在整個無菌操作過程中都應(yīng)該在酒精燈的周圍進行； 玻璃吸管、瓶口，金屬物品或耐熱的塑料、橡膠制品可以過火滅菌； 不耐熱的物品可以用75%酒精擦拭,3、實驗后：用75酒精擦拭超凈臺、邊臺。,細胞的原代和傳代培養(yǎng),原代細胞培養(yǎng)原理,細胞培養(yǎng)是模擬機體內(nèi)生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。 由體內(nèi)直接取出組織或細胞進行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細胞離體時

20、間短，性狀與體內(nèi)相似，適用于研究。 幼稚狀態(tài)的組織和細胞，如：動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養(yǎng),原代細胞培養(yǎng)操作（鼠胎組織細胞培養(yǎng)為例）,取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡，或用乙醚麻醉。把整個孕鼠浸入盛有75乙醇的燒杯中消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污 切割：用平衡鹽溶液將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。 消化、接種培養(yǎng)：加入0.25胰蛋白酶消化液（5-10

21、倍量），與組織塊混勻。置37水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動一下試管），靜止，吸去上清，加入510ml細胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),傳代細胞培養(yǎng)原理,體外培養(yǎng)的原代細胞或細胞株,當(dāng)細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中（傳代)，以便獲得穩(wěn)定的細胞株或得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續(xù) 傳代時，需將培養(yǎng)的細胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進行培養(yǎng) 細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細胞世代或倍增不同，在一代中，細胞培增36次,貼壁細胞傳代操作舉例,在超凈工作臺中倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液 用PBS 洗滌細

22、胞一至二次 加入少許消化液(以液面蓋住細胞為宜，如1ml/25cm2)，靜置510分鐘 在倒置鏡下觀察被消化的細胞，如果細胞變圓，相互之間不再連接成片，這時應(yīng)立即在超凈臺中將消化液倒掉，加入35ml新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細胞懸液（若不移去胰酶，則在作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止胰酶的作用），離心后再吸掉上清液，加新鮮培養(yǎng)液制成細胞懸液，計數(shù)細胞 將適量細胞懸液轉(zhuǎn)移到加到另一個培養(yǎng)容器中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。,細胞計數(shù),目的：培養(yǎng)的細胞要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示。 原理：當(dāng)待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中細胞的數(shù)目，即

23、可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù)目。 具體操作： 1. 取血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上。 2. 將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液。 3.統(tǒng)計四個大格的細胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，分別數(shù)出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中的細胞數(shù)。 4. 按照下面公式計算細胞密度： 細胞數(shù)/ml（四個大格子細胞數(shù)/4)104稀釋倍數(shù) 說明：公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細胞數(shù)。 公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為： 1.0mm（長）1.0mm（寬）0.1mm（高）0.1mm3而1ml1000mm3,細胞計數(shù)要

24、點： 1、要求懸液中細胞數(shù)目不低于104個/ml,且細胞分散良好； 2、取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混勻；,3、數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。 4、操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。,1、先將凍存管放入4冰箱，10min。 2、接著置入小的泡沫盒，置于-20冰箱，12h。 3、置于-80超低溫冰箱中放置過夜。 4、置于液氮罐中長期保存。,簡易方法,注意事項： 1、使用DMSO前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破華它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時最好戴上手套操作。 2、如沒有液氮，