1、,第二章,植物組織培養(yǎng)實驗室構建,（圖為濰坊職業(yè)學院生物技術專業(yè)組培中心）,植物組織培養(yǎng)是以無菌操作為基礎的，它需要在一定的實驗條件和特定的實驗環(huán)境下完成一系列操作，以無菌條件為重要前提，模擬植物細胞生長發(fā)育需要的各種設備、設施、培養(yǎng)條件，是從事本領域工作的基礎。,一、植物組織培養(yǎng)實驗室設計 二、儀器和設備 三、玻璃器皿和用具,主要內容,1、實驗室要求 環(huán)境要求：理想的植物組織培養(yǎng)實驗室應該建立在安靜、清潔、遠離污染源的地方，最好在常年主風向的上風方向，盡量減少污染。規(guī)?；a的實驗室最好建在交通方便的地方，便于產品的運送。 實驗室的建設均需考慮兩個方面的問題：一是所從事的實驗的性質，即是生產

2、性的還是研究性的，是基本層次的還是較高層次的；二是實驗室的規(guī)模，規(guī)模主要取決于經費和實驗性質。,一、實驗室設計,實驗室設置的基本原則是：科學、高效、經濟和實用。一個植物組織培養(yǎng)實驗室必須滿足3個基本的需要：實驗準備（培養(yǎng)基制備、器皿洗滌、培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿滅菌）、無菌操作和控制培養(yǎng)。此外，還可根據所從事的實驗要求來考慮輔助實驗室及其各種附加設施，使實驗室更加完善。,2、標準組織培養(yǎng)室組成,準 備 室,洗滌室,接種室,培養(yǎng)室,滅菌室,組培實驗室,馴化室,植物組織培養(yǎng)實驗室 的組成,分體式-研究性質實驗室，分開的若干房間將準備室分解為藥品貯藏室、培養(yǎng)基配制與洗滌室和滅菌室等，功能明確，便于管理，但不

3、適于大規(guī)模生產。 通間式-規(guī)?；瘜嶒炇遥话阍O計成大的通間，試驗操作的各個環(huán)節(jié)在同一房間內按程序完成。便于程序化操作與管理，減少各環(huán)節(jié)間的銜接時間，提高工作效率。還便于培養(yǎng)基配制、分裝和滅菌的自動化操作程序設計，減少規(guī)?；a的人工勞動，更便于無菌條件的控制和標準化操作體系的建立。,案例1：實驗室平面設計,案例2：實驗室構成,1、準備室 功能：又叫化學實驗室，進行一切與實驗有關的準備工作：器皿洗滌、完成所使用的各種藥品的貯備、稱量、溶解、配制、培養(yǎng)材料的預處理等。 要求：最好有20平方米左右。要求寬敞明亮、以便于放置多個實驗臺和相關設備，方便多人同時工作；同時要求通風條件好，便于氣體交換；實驗

4、室地面應便于清潔，并應進行防滑處理。 設備：準備室應具備工作臺、天平，柜櫥、水池、儀器、蒸餾水器，磁力攪拌器，冰箱等。,藥品柜,冰箱,天平,磁力攪拌器,恒溫水浴鍋,2、洗滌室（區(qū)）,功能：完成各種器具的洗滌、干燥、保存、材料預處理，同時兼顧試管苗出瓶等。 要求：需安裝一個較大的水池，水泥制作，白瓷磚砌內外表面，池底放一張橡膠墊，以減少玻璃器皿的破損。下水道應暢通，以免妨礙工作。 設備：玻璃器皿、塑料器皿、周轉箱、洗滌刷、洗瓶機、洗滌劑、晾干臺等。,要求：20 m2左右，明亮，通風。配置大型工作臺1張。 功能：培養(yǎng)基配制、分裝、 高壓滅菌，無菌水的制備以及其它物品的高壓滅菌等。 設備：高壓滅菌器

5、、電爐、不銹鋼鍋、培養(yǎng)基分注器、物品櫥1-3個，用以放置線繩、封口材料等。此外還應有烘箱、天平、酸度計、盆與桶等。,3、培養(yǎng)基制作與滅菌室（區(qū)）,要求：接種室要求干爽安靜，清潔明亮。接種室宜小不宜大，一般1020平米，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒，地面及內墻壁都應采用防水和耐腐蝕材料，室內物品越少越好。配置拉動門，以減少開關門時的空氣擾動；室外設有緩沖間。 功能：主要用于植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物的轉移、試管苗的繼代以及一切需要進行無菌操作的技術程序。 主要設備：紫外光源、超凈工作臺、消毒器、酒精燈、接種器械（接種鑷子、剪刀、解剖刀、接種針）、紫外線滅菌燈、空調等。,

6、4、無菌操作室（接種室）,緩沖間 功能：是進入無菌室前的一個緩沖場地，減少人體從外界帶入的塵埃等污染物。工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能進入無菌室和培養(yǎng)室。 要求：可建在準備室外（需3-5平方米）或無菌操作室外（面積1平方米為宜），應保持清潔無菌；備有鞋架和衣帽掛鉤，并有清潔的實驗用拖鞋、已滅菌過的工作服；墻頂用1-2盞紫外燈定時照射，對衣物進行滅菌。 設備：1-2盞紫外燈、滅菌后的工作服、拖鞋、口罩。,5、培養(yǎng)室（區(qū)） 功能：對接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物離體材料進行控制條件下的培養(yǎng)，無論是研究性實驗室還是生產性實驗材料進行培養(yǎng)的場所。 要求：約需10-20平方米左右。基本要求是能

7、夠控制光照和溫度，并保持相對的無菌環(huán)境，因此，培養(yǎng)室應保持清潔和適度干燥；為滿足植物培養(yǎng)材料生長對氣體的需要，還應安裝排風窗和換氣扇等培養(yǎng)室的換氣裝置；為節(jié)省能源和空間，應配置適宜的培養(yǎng)架，并安裝日光燈照明。 主要設備：培養(yǎng)架（控溫控光控濕）、溫濕度計、搖床、培養(yǎng)箱、光源、除濕機、換氣扇、紫外光源等。,6.觀察室,功能：觀察并研究培養(yǎng)材料的生長分化情況及其形態(tài)發(fā)生規(guī)律；檢查培養(yǎng)材料是否脫毒和發(fā)生變異。 主要配備：生物顯微鏡，切片機，酶聯免疫檢測儀，PCR擴增儀等。,要求：室內清潔、明亮、安靜，設備先進。,7. 馴化棚室,要求：能夠控溫調濕、控光通風。 面積：據規(guī)模來定。 注：室內馴化與設施下馴

8、化均可。,功能：提供組培苗煉苗的環(huán)境。,作業(yè)： 植物組織培養(yǎng)基本實驗室包括哪些組成?各有何功能與要求？,二、儀器和設備,、烘箱 陳列于洗滌室 作用：干燥洗后的器皿 高溫干熱滅菌 測定培養(yǎng)物的干重 氣浴,、冰箱,各種維生素和激素類藥品以及培養(yǎng)基母液均需低溫保存，某些試驗還需植物材料進行低溫處理，普通冰箱即可。 陳列于 中,4、加熱器 用于培養(yǎng)基的配制。研究性實驗室一般選用帶磁力攪拌功能的加熱器，規(guī)?；笮蛯嶒炇矣么蠊β始訜岷碗妱訑嚢柘到y(tǒng)。 5、其它 純水器、分裝設備,6、超凈工作臺,其操作臺面是半開放區(qū)，具方便、操作舒適優(yōu)點，通過過濾的空氣連續(xù)不斷吹出，大于0.03um直徑的微生物很難在工作臺的

9、操作空間停留，保持了較好的無菌環(huán)境。由于過濾器吸附微生物，使用一段時間后過濾網易堵塞，因此應定期更換。 陳列于 中 類型：垂直式和水平式 作用：無菌操作用,7、酸度計,用于測定培養(yǎng)基及其它溶液的pH，一般要求可測定pH范圍1-14之間，精度0.01即可。 陳列于 中,PHS-802中文臺式酸度計,通用型或經濟型酸度計,8、顯微鏡,陳列于觀察室中 類型： 倒置顯微鏡 原生質體觀察 普通顯微鏡 染色體和葉片氣孔觀察 熒光顯微鏡 細胞活力觀察 解剖顯微鏡 立體觀察,9、天平,植物組織培養(yǎng)實驗室需要不同精度的天平。 感量0.001g的天平（分析天平）和感量0.0001g的天平（電子天平）用于稱量微量元

10、素和一些較高精確度的實驗用品。 感量0.01g和0.1g的天平，用于大量元素母液配制和一些用量較大的藥品的稱量。 陳列于 中,10、高壓滅菌鍋 用于培養(yǎng)基、玻璃器皿以及其它可高溫滅菌用品的滅菌，根據規(guī)模大小有手提式、立式、臥式等不同規(guī)格。,11、干熱消毒柜 用于金屬工具如鑷子、剪刀、解剖刀，以及玻璃器皿的滅菌。一般選用200左右的普通或遠紅外消毒柜。,13、紫外燈 方便經濟的控制無菌環(huán)境的裝置，緩沖間、接種室和培養(yǎng)室必備。,12、過濾滅菌器 用于一些酶制劑、激素以及某些維生素等不能高壓滅菌試劑的滅菌，主要有真空抽濾式和注射器式。,14、培養(yǎng)架 目前植物植物組織培養(yǎng)實驗室植株繁殖培養(yǎng)的通用設施。

11、成本低、設計靈活、充分利用培養(yǎng)空間。一般有4-5層，層間間隔30-40cm，長1.01.3米，寬0.6米，光照強度可根據培養(yǎng)植物特性來確定，一般每架上配備2-4盞日光燈。,15、培養(yǎng)箱 細胞培養(yǎng)、原生質體培養(yǎng)等要求精確培養(yǎng)的實驗，可用光照培養(yǎng)箱、CO2培養(yǎng)箱、濕度控制培養(yǎng)箱等培養(yǎng)。 16、搖床 進行液體培養(yǎng)時，為改善通氣狀況，可用振蕩培養(yǎng)箱或搖床。 17、生物反應器 進行植物細胞生產次生產物的實驗室，還需生物反應器。,其他設備 可安裝時間程序控制器、溫度控制系統(tǒng)或空調；實體顯微鏡、倒置式生物顯微鏡及配套的攝影、錄像和圖像處理設備；電泳儀、萃取和層析設備、紫外分光光度計、高效液相色譜儀、氣相色譜

12、儀、酶聯免疫測定系統(tǒng)。,1、培養(yǎng)容器 包括各種規(guī)格的培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、培養(yǎng)瓶。一般分為： 玻璃容器一般用無色并不產生顏色折射的硼硅酸鹽玻璃材質。 1.耐腐蝕；耐高溫、高壓； 2.透明度好； 3.便于接種。 塑料容器材質輕、不易破碎、制作方便，廣泛使用。一般為聚丙烯、聚碳酸酯材料的培養(yǎng)容器。,三、玻璃器皿和用具,三角瓶：50、100、250、500ml或用250ml罐頭瓶代替。 培養(yǎng)皿：6、9、12cm 試管：18180mm或20200mm 量筒：10、50、100、500、1000ml 燒杯：50、100、200、500、1000ml 容量瓶：100、200、500、1000ml 試劑瓶（

13、棕色）：50、100、250、500、1000ml 移液管：0.2、0.5、1.0、2、5、10ml,玻璃器皿的規(guī)格：,刻度移液管 在配制培養(yǎng)基時，生長調節(jié)物質和微量元素等溶液，用量很少，只有用相應刻度的移液管才能準確量取。同時，不同種類的生長調節(jié)物質，不能混淆，這就要求專管專用。常用的移液管容量有0.1ml、0.2ml、0.5ml、2ml 、5ml、10ml等。,1）鑷子類：接種、轉移材料或分離莖尖用，以100ml三角瓶為培養(yǎng)瓶，可用20cm長。,2、金屬用具,2）剪刀類：醫(yī)用剪刀，剪切割外植體或繼代培養(yǎng)時分離材料。,3）解剖刀：切割芽、莖段、愈傷組織等，繼代時分離材料，也可用于微小外植體的

14、接種等。,4）解剖針：轉移細胞或愈傷組織，微莖尖分離及接種等。,5）其它：周轉筐 搪瓷盤 移液管架 、玻璃棒、酒精燈、試管架等。,3、塑料用具 各種封口膜、蓋、塑料盤及其它實驗用具。,思考題 1、植物組織培養(yǎng)實驗室包括哪些部分？ 2、植物組織培養(yǎng)實驗室的常規(guī)設備有哪些？ 3、簡述無菌操作設備的類型及作用？,一、內容 1新器皿洗滌 新玻璃器皿，無論是軟玻璃或硬玻璃，都有游離的堿性物質，會影響組培試驗結果，使用前必須洗滌。 2使用過的一般器皿如試管、燒杯、三角瓶等的洗滌。洗好后的瓶子應透明锃亮，內外壁水膜均一，不掛水珠。 3使用過的量器如移液管、容量瓶、滴管及載玻片、蓋玻片等的洗滌 二、材料準備 各種培養(yǎng)瓶、移液管、洗衣粉、洗液、周轉箱、瓶刷、洗滌池、蒸餾水等。,實踐二 洗滌技術,三、方法與措施 1.新玻璃器皿先用1%的Hcl溶液浸泡