1、實(shí)驗(yàn)十 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)常見蛋白質(zhì)含量測定的原理和方法 2. 掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量的方法,二、原理,一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行定性分析,維生素B12溶液的吸收光譜,主要方法： （1）比較吸收光譜曲線 （2）比較最大吸收波長 蛋白質(zhì)的最大吸收波長為280nm； 核酸的最大吸收波長為260nm。 （3）比較吸光度的比值 純DNA：,（二）利用吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行定量分析,1原理 Beer-Lambert（比爾）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=cl 其中：T為透光率；A為吸光率；I0為入射光強(qiáng)度；I為透射光

2、強(qiáng)度； 為摩爾消光系數(shù)；C為溶液濃度；L為溶液光程的厚度,2常用方法 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品的測定條件必須一致。,（2）標(biāo)準(zhǔn)管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，測定AS、AX可求得CX。 （3）摩爾吸光系數(shù)法 C=A/（為L=1cm，C為1 mol/L時(shí)的吸光系數(shù)，也稱為摩爾吸光系數(shù)。,微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)總含量,被測的天然含氮化合物與濃硫酸共熱時(shí)分解出氨，氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨。在凱氏定氮儀中加入強(qiáng)堿堿化消化液，使硫酸銨分解出氨。用水蒸汽蒸餾法將氨蒸入無機(jī)酸溶液中，然后再用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液進(jìn)行滴定，滴定所用無機(jī)酸的量(mol)相當(dāng)于被測樣品中氨的量（mol），根據(jù)所測得的氨量即可

3、計(jì)算樣品的含氮量。 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)含氮量通常在16 %左右，所以將凱氏定氮法測得的含氮量乘上系數(shù)6.25，便得到該樣品的蛋白質(zhì)含量。,Folin-酚試劑法(Lowry法)測定蛋白質(zhì)濃度,蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵(CONH)，因此有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中，能與Cu2+形成絡(luò)合物。Folin酚反應(yīng)是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上，引進(jìn)Folin試劑(磷鉬酸磷鎢酸試劑)，蛋白質(zhì)銅絡(luò)合物能還原磷鉬酸磷鎢酸試劑，生成藍(lán)色物質(zhì)。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的量成正比例。本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、靈敏度高、較紫外吸收法靈敏1020倍，較雙縮脲法靈敏100倍。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。（Tris緩沖劑、蔗糖、硫酸銨

4、、巰基化合物、酚、檸檬酸）。,紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度,由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280 nm波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值(OD280)與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測定。 利用紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速、簡便、不消耗樣品、可回收利用、低濃度鹽類不干擾測定。,含有核酸的樣品： 蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45A2800.74A260,總蛋白定量分析BCA（Bicinchoninic acid，二辛可寧酸、二羧基二喹啉）,準(zhǔn)確靈敏：BCA試劑的蛋白質(zhì)測定范圍是202000g/ml；Micro B

5、CA試劑測定范圍是0.5-20g/ml 快速：45分鐘內(nèi)完成測定，比經(jīng)典的Lowry法快4倍而且更加方便 經(jīng)濟(jì)實(shí)用：除試管外，測定可在微孔板中進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量 不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響 檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)小于考馬斯亮藍(lán),基本原理： 堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計(jì)算待測蛋白的濃度。,考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白質(zhì)濃度,考馬斯亮藍(lán)在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律 ，因此可以通過測定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。該法簡單、迅

6、速、干擾物質(zhì)少、靈敏度高（比Lowry法靈敏4倍）。,Coomassie Dye-Based 蛋白質(zhì)定量,雙縮脲法測定蛋白質(zhì)* 雙縮脲反應(yīng)：雙縮脲在堿性條件下與銅離子結(jié)合生成紫紅色化合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。本法測定蛋白質(zhì)范圍1-10mg H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3 雙縮脲,三、操作步驟 1.取15支試管，按下表編號(hào)、加試劑,2.各管混勻后，加入雙縮脲試劑3.0mL,37oC反應(yīng)30min。 3.以0號(hào)管調(diào)零，測定各管540nm光吸收值。,四、結(jié)果處理 1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，OD540為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)

7、準(zhǔn)曲線。 2.樣品的計(jì)算 根據(jù)樣品的OD540從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品的蛋白質(zhì)含量（mg/mL），再根據(jù)樣品的體積算出樣品的濃度。 五、注意事項(xiàng) 1. 須于顯色后30min內(nèi)測定，且各管由顯色到比色時(shí)間應(yīng)盡可能一致。 2.*樣品蛋白質(zhì)含量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。 3. 比色杯的使用,微量表達(dá)法 10-3 (g, m, L) milligram 毫（克） mg 10-6 microgram 微（克） g 10-9 nanogram 納（克） ng 10-12 picogram 皮 （克） pg 10-15 femtogram 飛（克） fg 10-18 attogram 阿、渺（克） ag 10-24

8、zepto（仄普托） 沙（克） zg ppm: parts per million 1 g/ml 1ppm ppb: parts per billion 1 ng/ml 1ppb ppt: parts per trillion 1 pg/ml 1ppt,五、分光光度計(jì)的使用 儀器操作鍵介紹 “方式設(shè)定”鍵（MODE）：用于設(shè)置測試方式 “100%T/0ABS”鍵：用于自動(dòng)調(diào)整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%T”鍵：用于自動(dòng)調(diào)整零透射比 “波長設(shè)置”旋鈕：用于設(shè)置分析波長,3.樣品測試操作 打開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘 用“波長設(shè)置”按鈕將波長設(shè)置在您將要使用的分析波長位置上 打開樣品室蓋，將擋光體插入比色皿架，并將其推或拉入光路 蓋好樣品室蓋，按“0%T”鍵調(diào)透射比零 取出擋光體，蓋好樣品室蓋，按“100%T”調(diào)100%透射比 按“方式鍵”（MODE）將測試方式設(shè)置為吸光度方式(A) 將參比溶液和被測溶液分別倒入比色皿中 打開樣品室