1、實(shí) 驗(yàn) 二 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí) 驗(yàn) 原 理,1、酶促反應(yīng)的特性：高效性、高特異性、高不穩(wěn)定性、可調(diào)節(jié)性。 反應(yīng)體系的條件必須嚴(yán)格控制。 2、酶活性測(cè)定的基礎(chǔ)是化學(xué)反應(yīng)速度的比較，即酶催化的化學(xué)反應(yīng)速度與無(wú)酶或酶失活情況下化學(xué)反應(yīng)速度的比較。 反應(yīng)速度通常以測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物生成量或底物的減少量來(lái)確定。,3、酶催化反應(yīng)的典型曲線(xiàn)是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)速度下降，由起初的直線(xiàn)變?yōu)榍€(xiàn)。 測(cè)定酶活性的所有反應(yīng)速率的比較都必須依賴(lài)該曲線(xiàn)的線(xiàn)性部分，因此要測(cè)定最初反應(yīng)速度，即底物濃度變化在底物起始濃度的5以?xún)?nèi)的速度。,4、實(shí)驗(yàn)對(duì)象：堿性磷酸酶（AKP）,磷酸苯二鈉,堿性磷酸酶,苯酚磷酸氫二鈉,4-氨基

2、安替比林,K3Fe（CN）6,醌衍生物（紅色）,堿性條件,一、pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響 堿性磷酸酶（AKP）的最適pH值是10。 二、溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響 堿性磷酸酶（AKP）的最適溫度是37。,三、底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測(cè)定,米-曼氏（Michaelis-Menten）方程：,Lineweaver-bulk（林貝氏方程）方程：,操作：,1、不同濃度基質(zhì)液的配制：,混勻。,2、另取試管9支，做酶促反應(yīng)：,混勻，37 水浴保溫5分鐘左右。,加入酶液后立即計(jì)時(shí)，各管混勻后在37 準(zhǔn)確保溫15分鐘。 3、保溫結(jié)束，立即加入0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止

3、反應(yīng)。 4、各管分別加入0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml及0.5 鐵氰化鉀 2.0 ml，充分混勻，放置10分鐘，以管1為對(duì)照，于波長(zhǎng)510 nm處比色。,酶活性計(jì)算及Km值求取 1、在37C下保溫15分鐘產(chǎn)生1mg酚為1個(gè)酶活性單位，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出釋放的酚量（ug），以此計(jì)算處各管的酶活性（v）。 2、以1/v為縱坐標(biāo)、1/S為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，求出酶的Km值。,Km？,四、抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)的影響,競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,反競(jìng)爭(zhēng)性抑制,實(shí)驗(yàn)所用的抑制劑是磷酸氫二鈉。,操作,1、不同濃度基質(zhì)液的配制：,混勻。,2、另取試管9支，做酶促反應(yīng)：,混勻，37 水浴保溫5分鐘左右。,

4、加入酶液后立即計(jì)時(shí)，各管混勻后在37 準(zhǔn)確保溫15分鐘。 3、保溫結(jié)束，立即加入0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止反應(yīng)。 4、各管分別加入0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml及0.5 鐵氰化鉀 2.0 ml，充分混勻，放置10分鐘，以管1為對(duì)照，于波長(zhǎng)510 nm處比色。,酶活性計(jì)算及Km值求取 1、在37C下保溫15分鐘產(chǎn)生1mg酚為1個(gè)酶活性單位，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出釋放的酚量（ug），以此計(jì)算處各管的酶活性（v）。 2、以1/v為縱坐標(biāo)、1/S為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，求出酶的Km值，并判斷該抑制劑屬于何種類(lèi)型。,Km？ 該抑制劑為？,注意事項(xiàng)：,配制的各種試劑及反應(yīng)液必須混勻。 加酶液要準(zhǔn)確快速，以保證各管酶促反應(yīng)同時(shí)開(kāi)始。 加入酶液后要立即計(jì)時(shí)，計(jì)時(shí)要準(zhǔn)確