1、蛋白質和氨基酸測定,學習目標 1.了解蛋白質和氨基酸的性質 2.明確蛋白質和氨基酸測定方法 2.掌握凱氏定氮法測定蛋白質的過程及注意事項 3.了解氨基酸的性質和測定方法,蛋白質和氨基酸測定內(nèi)容,1. 概述 2. 凱氏定氮法 3 .蛋白質的快速測定法 4. 氨基酸總量的測定 5. 氨基酸的分離與測定,1. 概述,(1)蛋白質的生理功用及在食品中的作用 （2）食品中的蛋白質含量 （3）蛋白質系數(shù) （4）蛋白質水解 （5）蛋白質測定方法 (6)氨基酸的測定與分離方法,2. 凱氏定氮法,原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與

2、硫酸結合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以標準HCl溶液滴定。根據(jù)標準酸消耗量可以計算出蛋白質的含量。,食品中的蛋白質測定,原理、過程及試劑 消化蒸餾與吸收滴定 消化-濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀 蒸餾-氫氧化鈉 吸收-硼酸 滴定-鹽酸、混合指示劑,消化,蒸餾與吸收,消化液 + 40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。,滴定,用鹽酸標準溶液 滴定至終點. 然后進行計算.,微量凱氏定氮裝置,蛋白質測定儀-消化、蒸餾吸收,蛋白質測定儀-滴定,KDN型蛋白質測定儀,QSY-型蛋白質測定儀,3 .蛋白質的快速測定法,傳統(tǒng)的凱氏定氮法應用范圍廣，靈敏度高、準確，不要大儀器，但費時間，有環(huán)境污染

3、。 新開發(fā)的：雙縮脲法、 紫外分光光度法、 染料結合法、 水楊酸比色法等。 下面簡單介紹雙縮脲法,1.原理 脲（尿素）NH2CONH2 加熱至150160時，兩分子縮和成雙縮脲。,雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡和物，這種反應叫雙縮脲反應。（縮二脲反應） 蛋白質分子中含有肽鍵 CONH 與雙縮脲結構相似。在同樣條件下也有呈色反應，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質含量成正比，可用分光光度計來測其吸光度，確定含量。（560nm）,NH2CONHCONH2 + NH3,方法特點及應用范圍,本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學領域中測定蛋白質含量時常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作

4、物種子及肉類等樣品測定。,4. 氨基酸總量的測定,（一）甲醛滴定法 （二）茚三酮的比色法,（一）甲醛滴定法,1.原理：氨基酸本身有堿性 NH2 基，又有 酸性 COOH 基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，甲醛與 NH2 結合，堿性消失，再用強堿來滴定 COOH 基。,2適用范圍：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氮量，其發(fā)酵過程中氮量減少情況及食品中游離氨基酸的測定等。 3試劑： 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至藍色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液， 0.1%中性紅50%乙醇溶液， 0.1 mol/L 氫氧化鈉標準溶液。,4操作：同時取兩份樣： 一份中加中性紅指示劑，用

5、氫氧化鈉直接滴，中和樣液中其它酸性物質。 另一份中加百里酚酞、中性甲醛用NaOH 滴，中和了樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質的總和。 二者之差可計算氨基酸含量,（二）茚三酮的比色法,原理：氨基酸在一定條件下與茚三酮起反應，生成藍紫色化合物，可比色定量。,5. 氨基酸的分離與測定,（一）薄層色譜法 （二）氨基酸自動分析儀法 （三）氣相色譜法 （四）高效液相色譜法,（一）薄層色譜法,原理： 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種混合物可達到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標準氨基酸進行對比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點顏色的深淺可以大致確定其含量。,Rf = a / b,a,b,樣點,溶劑前沿,點樣原點,操作方法： 薄層板制備 樣品液制備 點樣 展開 顯色,（二）氨基酸自動分析儀法,（三）氣相色譜法,