1、,Chimeric antigen receptor T-cell therapy,CAR-T細胞治療,1,目,錄,1,2,3,4,5,6,概述,CAR-T細胞治療的安全性,CAR-T細胞治療的臨床應用,CAR-T細胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的不良反應,分子結構,CAR-T細胞治療的流程,7,展望,2,1. 概述,2011年，美國賓夕法尼亞大學June教授研究組報道了采用抗CD19單抗、4-1BB和TCR/CD3的鏈構建嵌合型抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）修飾T細胞治療3例晚期慢性淋巴細胞白血病(CLL)病例的臨床研究，3例CLL治療后2例達到完全緩解(已隨

2、訪10和11個月)，1例為部分緩解1。研究結果表明抗CD19 CAR在治療B系惡性腫瘤中的良好前景。 在此之后，針對復發(fā)和難治B細胞淋巴瘤/白血病的CAR-T細胞免疫治療便迅速受到全球淋巴瘤相關專家和制藥公司的關注和跟進。,1徐曉軍，趙海招，湯永民.嵌合抗原受體技術免疫治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的研究進展.,3,1. 概述,1.1 CAR-T細胞概念 T細胞是人體內(nèi)發(fā)揮特異性抗腫瘤作用的效應細胞，其作用的發(fā)揮具有主要組織相容性復合物(main histocompatibility complex, MHC) 限制。 然而, 腫瘤免疫編輯的過程會使MHC在腫瘤細胞表面表達下降，破壞抗原加工過程, 降低

3、肽段免疫原性。這樣長期形成的免疫逃逸機制, 能使腫瘤細胞成功躲避T細胞攻擊, 腫瘤快速增殖。 而人體內(nèi)另一種特異性淋巴細胞B細胞的抗原受體及其分泌的抗體可以直接與相應的抗原結合。,4,1. 概述,1.1 CAR-T細胞概念 通過將識別腫瘤相關抗原(tumor associated antigen，TAA)的單鏈抗體(single chain fragment variable，scFv) 和胞內(nèi)信號域“免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAM, 通常為CD3或FcRI)”在體外進行基因重組，生成重組質(zhì)粒，

4、再在體外通過轉染技術轉染到患者的T細胞，使患者T細胞表達腫瘤抗原受體,轉染后經(jīng)過純化和大規(guī)模擴增后的T細胞，稱之為嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞)。 表達CAR的T細胞以抗原依賴、非MHC限制的方式結合腫瘤抗原, 啟動并活化特異性殺傷腫瘤反應。,5,1. 概述,1.2相關概念 MHC（主要組織相容性復合體）是由一群緊密連鎖的基因群組成，定位于動物或人某對染色體的特定區(qū)域，呈高度多態(tài)性。其編碼的分子表達于不同細胞表面，參與抗原遞呈，制約細胞間相互識別及誘導免疫應答。 人類的MHC通常稱為HLA基因或HLA復合體，其編碼的分子表達于白細胞上，稱為人類白細胞抗原(human leucocyte

5、antigen，HLA)。 白細胞分化抗原是白細胞在正常分化成熟不同譜系和不同階段以及活化過程中，出現(xiàn)或消失的細胞表面標記。應用以單克隆抗體鑒定為主的聚類分析法，將識別同一分化抗原的來自不同實驗室的單克隆抗體歸為一個分化群或分化抗原簇（cluster of differentiation,CD）。 T細胞抗原受體( T cell antigen receptor，TCR）是T細胞特異性識別抗原肽-MHC復合體，啟動T細胞增殖分化，進而誘導特異性免疫應答的關鍵分子 。,6,1. 概述,T cell,Antigen -presenting cell,T細胞活化的“雙信號學說”,7,2. 分子結構,

6、圖1 嵌合抗原受體結構示意圖2,大多數(shù)CAR包括胞外抗原結合區(qū)(由來源于單克隆抗體的輕鏈和重鏈組成, 中間由帶韌性的鉸鏈區(qū)連接形成單鏈抗體)、跨膜區(qū)域(一般由同源或異源的CD3、CD8或CD28等二聚體膜蛋白組成)和胞內(nèi)信號轉導區(qū)(免疫受體酪氨酸活化基序, 通常為CD3或FcRI)組成。,2陳杰 ,王宇環(huán) ,羅成林 ,王慧琴 ,羅曉玲.嵌合抗原受體T細胞介紹及抗腫瘤臨床應用.,8,2. 分子結構嵌合抗原受體的演化,第一代CAR由單鏈抗體通過跨膜區(qū)域與胞內(nèi)信號傳導區(qū)(ITAM)相連, ITAM通常為CD3或FcRI。但第一代CAR設計的信號域是單一的信號分子，而腫瘤細胞表面共刺激分子表達減弱或缺

7、失，所以CAR修飾的T細胞( CAR-T細胞) 雖然能識別腫瘤細胞，但由于缺乏有力的“第二信號”，CAR-T細胞難以充分活化，在體內(nèi)存在時間短，臨床效果有限 。只能引起短暫的T細胞增值和較低的細胞因子分泌，不能提供長時間的T細胞擴增信號和持續(xù)的體內(nèi)抗腫瘤效應。,9,2. 分子結構嵌合抗原受體的演化,第二代CAR的胞內(nèi)信號轉導區(qū)引入了共刺激分子CM1, 主要為CD28分子。依照T細胞活化的“雙信號學說”，T細胞的激活和增殖需要共刺激信號。 在第1代CAR的基礎上引入1 個共刺激分子，不僅增加T 細胞的擴增倍數(shù)而且增強了T 細胞的抗腫瘤特性。,10,2. 分子結構嵌合抗原受體的演化,第三代CAR引

8、入了雙共刺激分子(CM1和CM2), 主要為CD28分子加上CD134或CD137?？稍鰪奣 細胞的殺瘤能力，并延長了T 細胞在體內(nèi)的存活時間。第3代CAR在T 細胞的擴增倍數(shù)、體內(nèi)存活時間以及分泌細胞因子的能力都較第2代有優(yōu)勢。,11,3. CAR-T細胞治療流程3,3 David M. Barrett, Nathan Singh, David L. Porter, Stephan A. Grupp, and Carl H. June. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer.,12,4.CAR-T細胞治療的臨床應用,1. CAR-T細胞在血

9、液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中的應用 目前正在開發(fā)的針對血液系統(tǒng)惡性腫瘤的CAR種類很多，主要包括利用抗CD19、抗CD20、抗Kappa輕鏈、抗CD22、抗CD23、抗CD30、抗CD70等抗體構建CAR修飾的T細胞或NK細胞進行抗腫瘤研究，其中以抗CD19、抗CD20單克隆抗體最為熱門。 CD19特異地表達于B淋巴細胞及B系腫瘤，是治療B系腫瘤很有潛力的靶點，也是CAR研究中的熱點。在美國，目前正在開展的應用抗CD19單克隆抗體構建CAR-T細胞治療血液系統(tǒng)腫瘤的臨床試驗有10余項，其中包括急性淋巴細胞白血病（ALL) 、慢性淋巴細胞白血病(CLL) 、非霍奇金淋巴瘤(NHL)等。,13,4.CAR

10、-T細胞治療的臨床應用,1徐曉軍，趙海招，湯永民.嵌合抗原受體技術免疫治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的研究進展.,14,4.CAR-T細胞治療的臨床應用,2. CAR-T 細胞在實體腫瘤中的應用 CAR具有賦予T 細胞更強的靶向性并能打破宿主免疫耐受狀態(tài)等理論優(yōu)勢，在白血病、淋巴瘤中取得了不錯的療效。 現(xiàn)在CAR-T 細胞在實體腫瘤中的應用主要包括卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌等。 但由于實體腫瘤的脫靶效應、免疫細胞不易進入實體瘤內(nèi)部等因素，該應用尚處于臨床前期試驗階段。,15,5.CAR-T細胞治療的安全性,根據(jù)現(xiàn)有的臨床試驗，CAR-T 細胞輸注的安全性良好，大部分患者能夠

11、耐受。目前對于CAR-T細胞治療的擔憂主要來自以下幾個方面：,插入突變2 CAR-T技術是在T細胞中插入一段外源DNA片段, 理論上說其結構已被破壞, 存在一定的致瘤風險。雖然目前并沒有關于基因改造T細胞致瘤性的報道, 但是研究者還是一直在關注此問題， 也在不斷通過優(yōu)化載體類型和轉染方式來降低插入突變的風險，某些研究中心已采用mRNA直接轉導T細胞的辦法以避免該風險。,01,16,02,5.CAR-T細胞治療的安全性,脫靶效應（off-target effect） 用于腫瘤治療的多數(shù)靶抗原在人體正常組織中也會有微量的表達，所以對靶抗原親和力強殺傷能力強的CAR-T與這類抗原作用勢必造成組織損傷

12、，即為脫靶效應。 腫瘤抗原分為腫瘤特異性抗原( tumor specific antigen，TSA) 和腫瘤相關抗原( tumor associated antigen，TAA) 。TSA 只表達于腫瘤細胞而不表達于正常細胞的抗原。TAA 是指一類既表達于腫瘤細胞，也表達于正常細胞的抗原。研究者首先考慮的是 TSA。但目前已知的TSA較少, 除了少數(shù)CAR-T試驗外, 大多數(shù)針對重要組織不表達或相對可損耗組織表達的TAA。 因此，在采用該手段治療時，必須個體化地權衡利弊。同時應盡量研發(fā)和采用特異性強的抗原。,17,03,5.CAR-T細胞治療的安全性,炎癥反應 CAR-T細胞輸注后在體內(nèi)腫瘤

13、抗原的刺激下活化，分泌大量IL-6、IFN-和TNF-等炎癥因子，形成細胞因子釋放綜合征，致使臟器損傷。此外，腫瘤細胞大量破壞后也可能出現(xiàn)腫瘤溶解綜合征及腎功能損害等表現(xiàn)。,18,6.CAR-T細胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的不良反應,6.1 B細胞發(fā)育不全（B-cell aplasia4） 以CD19、CD20為靶抗原的CAR-T治療B細胞惡性腫瘤時，B細胞發(fā)育不全是CD-19定向療法的預期結果，以CD19、CD20為靶抗原的CAR-T治療在高效殺傷惡性B細胞的同時也殺傷機體內(nèi)其他B細胞，導致患者長期處于免疫功能低下狀態(tài)。但可作為CD-19定向CAR-T細胞在體內(nèi)存活和有效性的指標。 B細胞發(fā)育不

14、全可以注射丙球蛋白作為補充治療。持續(xù)的B細胞發(fā)育不全即使使用替代療法也可能導致感染風險的增加。 CAR-T細胞在體內(nèi)消失后B細胞可以恢復，因此患者可以再接受CAR-T細胞。,4 Sara Ghorashian,1Martin Pule,and Persis Amrolia. CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy for haematological malignancies.,19,6.CAR-T細胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的不良反應,6.2 細 胞 因 子 釋 放 綜 合 征（cytokine release syndrome，CRS） 概念

15、5：淋巴細胞在應用單克隆抗體、細胞因子等治療或感染后出現(xiàn)活化、溶解，并釋放出大量細胞因子所導致的一組臨床綜合征。 臨床癥狀：發(fā)熱、乏力、頭痛、惡心、心動過速、低血壓、皮疹、呼吸急促等，嚴重者可導致多器官功能衰竭或者急性呼吸窘迫綜合征。 機制：CRS發(fā)生發(fā)展與CAR結構、腫瘤類負荷及類型以及患者基因多態(tài)性等相關，可通過設計安全的CAR或CAR-T細胞并嚴格限制每次輸注的細胞數(shù)量來降低CRS發(fā)生。 糖皮質(zhì)激素及細胞因子拮抗劑具有降低CRS相關死亡的作用。,5錢軍，周俊東，鄒志宏.細胞因子釋放綜合征的發(fā)生機制和防治策略.,20,6.CAR-T細胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的不良反應,6.2 細 胞 因 子

16、 釋 放 綜 合 征（cytokine release syndrome，CRS） Davila等6在觀察及處理16例白血病患者不良反應后， 總結出了糖皮質(zhì)激素應用的標準。 即嚴重CRS的診斷：（1）發(fā)熱至少連續(xù)3天；（2）出現(xiàn)兩種細胞因子分泌量至少增加75倍，或者一種細胞因子增加250倍；（3）至少出現(xiàn)下述1種臨床毒性反應 ：低血壓、低氧血癥（PO2 90%）、神經(jīng)系統(tǒng)異常（包括精神狀態(tài)改變、 思維遲滯 、癲癇）。,6 Marco L. Davila et al.Efficacy and Toxicity Management of 19-28z CAR T Cell Therapy in

17、B Cell Acute Lymphoblastic Leukemia.,21,6.CAR-T細胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的不良反應,6.3 CAR-T相關腦?。?Encephalopathy） 癥狀：失語、意識模糊、精神錯亂、譫妄、幻覺、癲癇等。具有自限性，持續(xù)2-3天。 發(fā)生機制：尚不明確。與CRS的嚴重程度無關，與是否應用塔西單抗無關。 發(fā)生時機：通常發(fā)生在細胞因子釋放綜合征的癥狀達到頂峰之后?？砂l(fā)生在高熱期間或熱退之后。 輔助檢查：CT、MR等檢查可無異常。腦脊液中的CD19CAR-Tcell檢測可能存在意義。,7Shannon L. Maude, M.D., Ph.D., etc.Chi

18、meric Antigen Receptor T Cells for Sustained Remissions in Leukemia,22,誘人的應用前景,尋找其他分子靶點,提高CAR有效性和安全性,CAR修飾的T細胞腫瘤免疫治療理論上的優(yōu)勢和臨床前期實驗結果,尋找腫瘤特異性抗原作為分子靶點和開發(fā)適合CAR的單鏈抗體,優(yōu)化CAR的結構，篩選出良 好治療潛質(zhì)的T細胞亞群,隨著研究的不斷深入，相信 不久的將來CAR修飾T細胞 會給腫瘤治療帶來新的希望,展望,展望,23,參考文獻,1徐曉軍，趙海招，湯永民.嵌合抗原受體技術免疫治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的研究進展. 2陳杰 ,王宇環(huán) ,羅成林 ,王慧琴

19、,羅曉玲.嵌合抗原受體T細胞介紹及抗腫瘤臨床應用. 3 David M. Barrett, Nathan Singh, David L. Porter, Stephan A. Grupp, and Carl H. June. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. 4 Sara Ghorashian,1Martin Pule,and Persis Amrolia. CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy for haematological malignancies. 5錢軍，周俊東，鄒志宏.細胞因子釋放綜合征的發(fā)生機制和防治策略. 6 Marco L. Davila et al.Efficacy and Toxicity Management of 19-28z CAR T Cell Therapy in B Cell Acute Lymphoblastic Leukemia. 7Shannon L. Maude, M.D., Ph.D., etc.Chimeric Antigen Receptor T Cells for Sustained Remissions