1、第七章 胚 胎 嵌 合 技 術(shù),王 子 玉 南京農(nóng)業(yè)大學 動物胚胎工程技術(shù)中心,動物克隆,主要內(nèi)容,一、研究概況 二、嵌合體動物定義 三、生產(chǎn)方法 四、應用前景 五、嵌合體研究存在的 問題,一、研究概況,嵌合體 (chimera)一詞源于古希臘神話，其意是指獅頭、羊身、龍尾等部分拼湊起來的怪獸。 中國的“龍”：九似 圖騰 “龍角似鹿、頭似駝、眼似鬼、項似蛇、腹似蜃、鱗似鯉、爪似鷹、掌似虎、耳似?！?嵌合在生物學上是指同一個體中，基因型相異的細胞或組織混合存在的狀態(tài)。,現(xiàn)代的胚胎工程技術(shù)中，也有一種叫胚胎嵌合的技術(shù)。它是將個胚胎細胞（同種或異種動物胚胎）合并，共同發(fā)育成個胚胎，即“嵌合胚胎”，然

2、后將這個胚胎移植給受體，讓其妊娠產(chǎn)仔。如果產(chǎn)下來的幼仔具有以上種動物胚胎的細胞，則稱其為“嵌合體動物”。 例如，用同一種類的黑鼠和白鼠胚胎嵌合，可生下黑白相間的花小鼠；不同種類的綿羊和山羊胚胎細胞嵌合，可生下綿山羊，它既有綿羊的特征，又有山羊的特征。,美國科學家將人類的干細胞加入到了許多動物的胚胎中，制造長著人的器官的嵌合體動物，例如豬體內(nèi)流著人的血液的“人豬”，羊體內(nèi)的肝臟80%的成分屬于人類的肝臟的“人羊”，老鼠頭顱里加入人的腦細胞的“人鼠”等。 “當人的器官在動物的體內(nèi)生長，擁有人類細胞的豬或老鼠，是不是會像人類一樣思考，卻和動物一樣行事？” “它們所帶給人類社會的恐懼，早已超越了人類認

3、知的界限和人類對科學成果的接納空間”。,“嵌合體”是在生物界非常普遍的自然現(xiàn)象。 孿生子在同一個子宮中發(fā)育時會發(fā)生細胞交流，大多數(shù)孿生子體內(nèi)都攜帶著某些來自其同胞的細胞，他們都是嵌合體。 在胎兒發(fā)育過程中，母體和胎兒也會發(fā)生細胞交流（從孕婦血液中可檢測到胎兒的細胞），多數(shù)母親體內(nèi)終生攜帶著她們生下的子女的某些細胞，許多人體內(nèi)也攜帶著他們的母親的某些細胞，這些母親、子女也都是嵌合體。 那些接受器官移植的人，更全都是嵌合體。,不同的物種也可以形成嵌合體。 例如把兩個來自異種動物的胚胎嵌合成一個胚胎，就可以培育出異種嵌合體動物，像綿羊-山羊嵌合體、馬-斑馬嵌合體等都已培育成功。 許多心臟病患者移植了

4、豬或牛的瓣膜，也是異種嵌合體。 重組DNA技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)事實上也都是在制造分子層次上的嵌合體。,用日本黑牛精子與荷斯坦母牛卵母細胞受精和利木贊牛精子與日本紅牛卵母細胞受精，通過體外胚胎聚合的方法，獲得2頭四品種嵌合體牛 鈴木達行1998,二、嵌合體動物定義,天然嵌合體？,騾子：不是。是雜種,三、生產(chǎn)方法,1 囊胚顯微注射法： 用顯微操作技術(shù)將供胚的全部內(nèi)細胞團注入除去部分內(nèi)細胞團的受胚囊胚腔中，或?qū)⒐┡叩牟糠謨?nèi)細胞團注入受胚的囊胚腔中，也可以向受胚囊胚腔中（或卵周間隙）注入16細胞至桑甚胚的卵裂球、胚胎干細胞或已分化的細胞，使其發(fā)育為嵌合胚胎的方法即為囊胚注入法。 囊胚腔注射法嵌合體獲得率最

5、高,2. 聚合法,是指將去除透明帶的兩枚8細胞至桑葚期胚胎，或來自兩個不同胚胎的卵裂球，或卵裂球與胚胎聚合在一起的方法。,酶消化法去除透明帶,0.2-0.5鏈霉蛋白酶在25-27下處理3min，移入含BSA（牛血清白蛋白）的培養(yǎng)液中終止酶的消化作用，用培養(yǎng)液洗凈卵子（三次）。,裸胚聚合：移入胚胎聯(lián)結(jié)液小滴（植物凝集素A，PHA，起粘合作用）中，培養(yǎng)10-20min，將融合胚輕輕移入20% PBS中洗滌兩次，繼續(xù)培養(yǎng)5h-10h后，移植入同期發(fā)情的受體輸卵管或子宮角中。,卵裂球聚合：取相同數(shù)量的兩個不同種屬的卵裂球裝入空的透明帶內(nèi)，加入PHA使其聚合，用瓊脂包埋后體外直接培養(yǎng)或移入兔輸卵管中使其

6、發(fā)育至囊胚，最后再移入受體子宮角內(nèi)。 卵裂球與胚胎聚合：將解離好的卵裂球慢慢釋放于另一個裸胚的正上方，使二者直接接觸，借助于PHA的作用使之聚合。,四、應用前景,胚胎嵌合是哺乳動物胚胎工程的重要組成部分，作為一種特殊的研究手段，在發(fā)育生物學、細胞生物學、胚胎學、病理學、免疫學、醫(yī)學以及動物生產(chǎn)等領(lǐng)域都有著重要的作用。,1.在發(fā)育及細胞生物學方面的運用,(1)研究胚胎分化規(guī)律 胚胎嵌合技術(shù)是研究分析哺乳動物發(fā)生機制的重要手段之一。將基因型不同的胚胎細胞嵌合在一起，根據(jù)其在嵌合體組織或器官中的分布及存活率情況，研究胚胎早期分化的規(guī)律。 同時，通過嵌合胚胎內(nèi)細胞團以外的細胞，可以研究各類胚細胞核的全

7、能性及其正常分化能力。,(2)研究性分化機理 利用嵌合體可以研究性別分化以及參與性分化的細胞及其規(guī)律。 (3)孤雌生殖 利用嵌合體技術(shù)，己獲得了孤雌生殖小鼠。胎盤發(fā)育不全。 鈴木達行等（1998）通過聚合從日本紅牛獲取的卵母細胞的孤雌生殖二倍體胚胎和用荷斯坦母牛卵母細胞進行IVF的胚胎，獲得2死1活3頭嵌合體犢牛。,2.在免疫學與醫(yī)學方面的運用,(1)用于免疫功能的分析 通過分析嵌合體中白細胞的免疫應答，可揭示正常的免疫防御機理。 (2)建立遺傳病動物模型 人類大多數(shù)遺傳疾病，都可以利用嵌合體技術(shù)建立特定的動物模型。 艾滋病病毒不能感染小鼠，無法用小鼠作為研究艾滋病的模型動物。但是如果我們設法

8、讓小鼠長有人的免疫系統(tǒng)，艾滋病病毒就可以感染這種嵌合體小鼠，它們目前已被用于試驗治療艾滋病的藥物。,3.在動物生產(chǎn)中的應用,(1)人工制造有特殊經(jīng)濟價值的個體 對水紹、狐貍、絨鼠等毛皮動物，利用胚胎嵌合體技術(shù)可以獲得用交配或雜交法不能獲得的毛皮花色類型。 (2)種間移植 用于分析胎兒與母體的相互關(guān)系，如將斑馬的受精卵，移植到馬體內(nèi)生產(chǎn)斑馬（拯救珍稀瀕危動物）。,(3)可作為外源基因的導入方法 把外源目的基因先導入干細胞，再通過胚胎干細胞介導法將目的基因轉(zhuǎn)入胚胎，這是轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)中基因?qū)氲囊环N重要手段。 (4)生產(chǎn)移植器官 人兔胚胎嵌合體：將來發(fā)育成某種特定器官，如能克服免疫排斥反應，有望用

9、于器官移植。,嵌合體的科研價值和醫(yī)學價值,如斯坦福大學魏斯曼實驗室最近向鼠胎注射進一些人神經(jīng)干細胞，制造出的小鼠大腦細胞中，摻雜有約1%為人腦細胞。 把人神經(jīng)干細胞注入鼠胎中，然后對不同發(fā)育階段的嵌合體鼠胎的腦進行解剖，就可以知道在胚胎發(fā)育過程人腦細胞是如何遷移的，從而有助于我們理解人腦的發(fā)育。,魏斯曼設想以后是否有可能制造出大腦全部由人腦細胞組成的小鼠，這才有了這樣的小鼠是否真的長著人腦、是否會像人那樣思考的可能，因而才有了倫理問題。 長著人的器官的嵌合體動物以后有可能被應用于器官移植。,五、嵌合體研究存在的問題,（一）嵌合體組織器宮的特異抗原性 在種內(nèi)動物嵌合體制備過程中發(fā)現(xiàn)，不管是兩種胚

10、胎，還是多種胚胎制成的嵌合胚胎，細胞間均能協(xié)調(diào)的生長發(fā)育，不發(fā)生免疫排斥現(xiàn)象。但是，無論是進行供體-供體、供體-受體動物間，還是進行嵌合體-供體、嵌合體-受體動物間的組織或器官移植，均會發(fā)生強烈的免疫排斥反應。,因此，嵌合組織并沒有因為成為嵌合體的一部分而改變免疫特性，而是在發(fā)育過程中，各自細胞的免疫抗原性表達可能被“掩蓋”，因而嵌合體中不同基因型組織之間或細胞之間并不發(fā)生排斥現(xiàn)象。而一旦離開嵌合體，其特異抗原性又表現(xiàn)出來。這為將來利用嵌合體生產(chǎn)人用器官造成了很大障礙,（二）種間嵌合體胚胎細胞分化、發(fā)育的局限性,不同種間的胚胎聚合形成嵌合體胚胎后，一種胚胎細胞 (供體)在另一種胚胎內(nèi)的存活、分

11、化和增殖會受到極大的限制。如大鼠和小鼠胚胎嵌合構(gòu)成的嵌合囊胚的組織學分析發(fā)現(xiàn)，大鼠來源的細胞和小鼠來源的細胞，雖然都能參與滋養(yǎng)層和ICM的形成，但有傾向性。大鼠來源的細胞更多地構(gòu)成滋養(yǎng)層細胞，而小鼠來源的細胞更多地分化為ICM。而且，異種胚胎的細胞群并不混合，在任何場合都形成一定的群體。這一事實表明，卵裂球在嵌合胚中的移動是相當受限的。對小鼠與琢鼠、不同的田鼠之間的種間嵌合體試驗也說明，不同基因型細胞的發(fā)育在不同組織器官中有區(qū)域性優(yōu)勢分布。,另外，綿羊和山羊嵌合體的產(chǎn)生，是嵌合體研究的重大突破。但綿、山羊的嵌合體大多于出生前死亡，反映了種間嵌合體細胞種細胞分化的限制性問題，也可能反映了不同種間

12、嵌合胚的發(fā)育與受體子宮的不協(xié)調(diào)關(guān)系，這主要來自以下3個方面的因素： 其一是受體胚胎細胞對供體細胞的排斥； 其二是兩種胚胎細胞在分化、發(fā)育和增殖方面的不協(xié)調(diào)性； 其三是受體子宮對嵌合胚胎內(nèi)異種胚胎的排斥。這些因素致使試驗中出現(xiàn)頻率較高的死胎、發(fā)育停滯或流產(chǎn)現(xiàn)象。,復習思考題,嵌合 嵌合體動物 嵌合體動物生產(chǎn)方法 囊胚顯微注射法 嵌合體動物應用前景,未嫁接的西瓜不能連作，避免重茬， 主要就是為了防枯萎病。而采用西瓜嫁接栽培，可有效防止西瓜枯萎病、 流膠病等，不僅可以連作，而且耐寒、耐貧瘠、抗旱、抗?jié)竦哪芰Χ己?強，并且由于砧木根系發(fā)達，營養(yǎng)供給充足，苗子長勢好，可減少以氮 肥為主的化肥的施用量的3

13、0，產(chǎn)量還可提高30左右，畝產(chǎn)優(yōu)質(zhì)西 瓜40005000公斤,科學家將這項胚胎嵌合技術(shù)大多應用于發(fā)育生物學、免疫學及醫(yī)學動物模型等學科的研究。例如。利用這項技術(shù)可以檢測動物胚胎干細胞的全能性。 在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，胚胎嵌合技術(shù)也大有用武之地。例如，對水貂、狐貍、絨鼠等毛皮動物，利用這項技術(shù)可以得到按傳統(tǒng)的交配或雜交法無法得到的皮毛花色后代，從而提高毛皮的價值，克服動物間雜交繁殖的障礙，創(chuàng)造出新的物種。 同時，這項技術(shù)還可進行異種動物彼此妊娠產(chǎn)仔，加快珍稀動物的繁殖。 例如，利用其他動物代替大熊貓妊娠產(chǎn)仔，能夠加快它的繁殖速度。也可通過這項技術(shù)培育出含有人類細胞的豬，使得豬器官能用作人類器官移植之用

14、。亦可將外源基因?qū)胍环N細胞和胚胎相合，生下含有該外源基因的嵌合體動物，并可遺傳下去，使它具有重要的研究和應用價值。 目前，科研人員已經(jīng)嵌合成功的嵌合體動物有小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬和牛等；種間嵌合體動物有大鼠小鼠嵌合體、綿羊山羊嵌合體、馬斑馬嵌合體、黃牛水牛嵌合體等。,將兩枚胚胎細胞 (同種或異種動物胚胎)融合共同發(fā)育成為一個胚胎為嵌合胚胎。將該胚胎移植給受體，妊娠產(chǎn)仔，如該仔畜具有以上兩種動物胚胎的細胞稱之為嵌合體動物。嵌合體一詞起源于希臘神話，它是指獅頭、羊身、龍尾的一種怪物。如同種類黑鼠和白鼠胚胎嵌合，生下黑白相間的花小鼠。不同種的綿羊和山羊胚胎細胞嵌合，可生下綿山羊，既有綿羊的特征。又有山羊的特征。該技術(shù)多應用于發(fā)育生物學、免疫學和醫(yī)學動物模型等科的研究。利用該項技術(shù)亦可檢測動物胚胎干細胞的全能性，即將胚胎干細胞和同種動物胚胎嵌合，如生下嵌合體，包括生殖系在內(nèi)組織細胞嵌合，即可確認該干細胞具有全能性。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中亦具有重要意義，如對水貉、狐貍、絨鼠等毛皮動物，利用嵌合體可以得到按傳統(tǒng)的交配或雜交法不能得到的皮毛花色后代，提高毛皮的商品性能，可以克服動物間雜交繁殖障礙，創(chuàng)造出新的物種。亦設想利用