1、,微生物學(xué)檢驗(yàn),第十四章真菌檢驗(yàn)技術(shù),返回總目錄,本 章 內(nèi) 容,學(xué)習(xí)目標(biāo)及重點(diǎn),學(xué)習(xí)目標(biāo)： 掌握真菌的檢驗(yàn)方法 熟悉真菌標(biāo)本采集及注意事項(xiàng)；真菌的鑒定程序；真菌藥物 敏感試驗(yàn)方法 了解常用抗真菌藥物 本章重點(diǎn)： 臨床真菌標(biāo)本的采集和處理 真菌的形態(tài)學(xué)檢查、培養(yǎng)技術(shù)和鑒定試驗(yàn) 真菌藥物敏感試驗(yàn),第一節(jié) 真菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù),一、標(biāo)本的采集和處理 1. 標(biāo)本的采集根據(jù)真菌感染部位采集不同的標(biāo)本,取毛發(fā)、皮屑、指（趾）甲等標(biāo)本,取痰液、膿汁、血液、腦脊液等標(biāo)本,2. 標(biāo)本采集注意事項(xiàng),第一節(jié) 真菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù),臨床標(biāo)本,分離培養(yǎng),直接檢查,免疫學(xué)檢查,觀察菌落,生化反應(yīng),染色 鏡檢,直接 鏡檢,3.

2、檢驗(yàn)程序,核酸檢測(cè),其他鑒定試驗(yàn),形態(tài)學(xué)檢查,病理組 織標(biāo)本,動(dòng)物實(shí)驗(yàn),鏡檢,PAS,HE,第一節(jié) 真菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù),二、直接鏡檢,標(biāo)本處理液： （1）KOH溶液 適于檢查致密的難以透明的材料 （2）生理鹽水 用于觀察真菌的出芽現(xiàn)象 （3）水合氯醛-石炭酸-乳酸封固液 透明力較強(qiáng)，只限于不透明的標(biāo)本,鏡檢,注意真菌與其他混雜物的鑒別,第一節(jié) 真菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù),三、染色鏡檢 革蘭染色：各種真菌均為革蘭陽性（圖1） 乳酸酚棉藍(lán)染色：染成藍(lán)色（圖2） 墨汁染色：背景染成黑色，菌體不著色（圖3） 熒光染色：熒光顯微鏡下發(fā)出熒光 糖原染色：多糖成分呈紅色，核為藍(lán)色，背景為淡綠色,返回章內(nèi)容,（圖1）,（

3、圖3）,（圖2）,第一節(jié) 真菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù),第二節(jié) 真菌培養(yǎng)技術(shù),一、基本條件 1.常用工具 平皿、試管、接種針、接種環(huán)、接種鉤、培養(yǎng)箱等,一、基本條件 2.培養(yǎng)基 真菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，最適pH 4.06.0 常用的培養(yǎng)基:,第二節(jié) 真菌培養(yǎng)技術(shù),顯色鑒定培養(yǎng)基,真菌特異性酶的底物（無色）,產(chǎn)色基團(tuán)游離（顯色）,真菌的酶 分解代謝基質(zhì),原理,第二節(jié) 真菌培養(yǎng)技術(shù),第二節(jié) 真菌培養(yǎng)技術(shù),二、培養(yǎng)方法,僅用于培養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖較快的真菌,觀察真菌結(jié)構(gòu)及生長(zhǎng)發(fā)育過程,多用于菌種傳代接種與保存,第二節(jié) 真菌培養(yǎng)技術(shù),三、生長(zhǎng)現(xiàn)象,類酵母型菌落,絲狀菌落,觀察菌落,生長(zhǎng)速度、菌落大小、表面形態(tài)、性質(zhì)、顏色、邊緣

4、、底部等,酵母型菌落,返回章內(nèi)容,第二節(jié) 真菌培養(yǎng)技術(shù),一、常用生化試驗(yàn),第三節(jié) 真菌的鑒定方法,二、免疫學(xué)檢查,第三節(jié) 真菌的鑒定方法,三、其它鑒定診斷方法 l. 厚膜孢子形成試驗(yàn),接種,玉米粉吐溫-80瓊脂,25孵育13天,待測(cè)菌,每天于顯微鏡下觀察,應(yīng)用：白假絲酵母菌的鑒定,方法：,結(jié)果：白假絲酵母菌在72小時(shí)內(nèi)可觀察到豐富的假菌絲，假菌絲頂端見12個(gè)厚膜孢子,第三節(jié) 真菌的鑒定方法,2.芽管形成試驗(yàn),方法： 待測(cè)菌+0.51ml血清,37水浴23小時(shí),鏡檢,應(yīng)用：白假絲酵母菌的鑒定,三、其它鑒定診斷方法,結(jié)果：絕大部分白假絲酵母菌可形成典型的放大鏡柄狀芽管,芽管,第三節(jié) 真菌的鑒定方法

5、,三、其它鑒定診斷方法,3. 動(dòng)物接種,4. 病理組織檢查,5. 核酸檢測(cè),6. 真菌毒素的檢測(cè),用于分離病原性真菌、確定真菌的致病性、研究抗真菌藥物,用于深部真菌感染的診斷,用于真菌的分型鑒定,有ELISA、生物學(xué)方法、薄層層析法、高效液相色譜法等多種方法,7. G試驗(yàn),用于念珠菌、曲霉菌等深部真菌感染的早期診斷,返回章內(nèi)容,第三節(jié) 真菌的鑒定方法,第四節(jié) 真菌藥物敏感試驗(yàn),一、臨床常用抗真菌藥物,第四節(jié) 真菌藥物敏感試驗(yàn),二、酵母菌藥敏試驗(yàn)方法微量稀釋法 1試驗(yàn)前準(zhǔn)備,RPMI 1640培養(yǎng)基 （含L-谷氨酰胺、酚紅，不含碳酸氫鈉）,培養(yǎng)基,第四節(jié) 真菌藥物敏感試驗(yàn),2方法,第四節(jié) 真菌藥物敏感試驗(yàn),3結(jié)果判斷,4. 質(zhì)量控制 采用標(biāo)準(zhǔn)菌株作為每次測(cè)定質(zhì)控菌株，其MIC應(yīng)落在預(yù)期值范圍內(nèi),第四節(jié) 真菌藥物敏感試驗(yàn),二、酵母菌藥敏試驗(yàn)方法紙片擴(kuò)散法 1試驗(yàn)前準(zhǔn)備,商品化含藥物紙片,藥物紙片,用無菌生理鹽水調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠁挝?待檢菌液制備,含葡萄糖和亞甲藍(lán)的M-H瓊脂,第四節(jié) 真菌藥物敏感試驗(yàn),二、酵母菌藥敏試驗(yàn)方法紙片擴(kuò)散法 2方法,用無菌棉簽蘸取菌液,35孵育1824小時(shí) 若生長(zhǎng)不良可延長(zhǎng)至48小時(shí),貼上藥物紙片,