1、免疫學實驗技術,免疫學技術-抗原抗體反應,可對抗原或 抗體進行定性、 定量、定位的 檢測 影響因素: 電解質、溫度 酸堿度,免疫標記技術: 是指用熒光素、放射性同位素、 酶、發(fā)光劑或電子致密物質等作為示蹤劑,標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應,特點:高度靈敏、特異、快速, 定性、定量、 定位 分類:免疫酶技術、免疫熒光技術、放射 免疫技術、免疫電鏡技術、免疫膠 體金技術和發(fā)光免疫測定,.ELISA .免疫組化 .熒光抗體標記 .熒光原位雜交（FISH） .分光光度法,.酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）,以酶標記抗體或抗原進行的抗體

2、抗原反應. 酶結合物具有雙功能:高度特異的免疫反應、 生物催化放大作用 基本方法:間接法、雙抗體夾心法、競爭法、 生物素-親和素系統(tǒng),間 接 法,a.將已知可溶性抗原吸附于載體 b.溫育后清洗 c.加入可能含特異性抗體的待檢液 d.溫育后清洗 e.加入酶標記的二抗 f.溫育后清洗 g.加入酶作用底物 h.測定反應顏色深淺,a.將已知抗體吸附于載體上 b.溫育后清洗 c.加入可能含特異性抗原的待檢液 d.溫育后清洗 e.加入酶標記特異性抗體 f.溫育后清洗 g.加入酶作用底物 h.測定顏色反應深淺,雙抗體夾心法,a、將已知抗體吸附于載體上 b、溫育后清洗 c、加入可能含特異性抗原的待檢液和酶標記

3、的已知抗原液 d、溫育后清洗 e、加入酶作用底物 f、測定顏色反應深淺,競 爭 法,生物素-親和素系統(tǒng)（biotin-avidin system） 生物素:一種維生素H,經活化后可與抗體、抗原、 酶以多 配一方式共價結合,且不影響它們的活性 親和素:從卵蛋白中提取的一種堿性糖蛋白,可與 酶偶合,以一配多的方式對生物素有很強的親和力 BAS用于檢測的基本方法：BAB法或BRAB法/BA 法/ABC法,生物素-親和素系統(tǒng),BAS法與常規(guī)酶法,ELISA操作注意事項,1.待檢樣品不應反復凍融 2.加樣前充分混勻樣品 3.洗板:保證洗滌次數(shù),確保沖洗干凈 4.加完終止液在要求時間內上機檢測,反應溫度最

4、好在37,ELISA檢測標本,1.血清或血漿 2.尿液 3.腦脊液、關節(jié)液等體液 4.細胞培養(yǎng)上清等,ELISA試驗用耗材、試劑及儀器,耗材:移液器、吸頭、酶標板、濾紙 試劑:酶標抗體、抗體稀釋液、封閉液、底物 溶液、終止液 儀器:酶標儀,ELISA結果分析,1.根據標準品的含量及檢測OD值結果,應用線性回歸方程進行統(tǒng)計分析,可求得待測樣品的定量值 2.上機前將標準品的數(shù)量及含量按要求在酶標儀上進 行設置,機器自動計算打印出標準曲線及各待測樣品的定量結果,.免疫組織化學技術,免疫組化是組織化學的一種,是利用已知的 抗體或抗原能特異性結合的特點,通過化學反 應使結合在特異性抗體上顯示劑(酶、金屬

5、離 子、同位素等)顯示一定的顏色,在顯微鏡下觀 察顏色的變化,在抗原抗體結合部位確定組織、 細胞結構的化學成份或化學性質,1.陽性標記色度特征,免疫組化細胞陽性程度與抗原含量、分布密 度、標記方法有關. 一般抗原含量越多、密度 越高、標記方法越敏感,陽性顯色則越強.淡黃 色,弱陽性;黃色,陽 性;棕黑色,強陽性 .結果判 斷中,后兩者有意義,前者除標本處理和方法學 因素外,與細胞輕度異常表達及某些細胞攝取 了周圍組織抗原有關,2.陽性標記細胞學特征,免疫組化陽性細胞反映抗原在細胞中的定位 和分布情況.陽性細胞以擬標記的細胞為前提, 陽性表達必須在細胞特定的抗原部位,若不在 抗原所在部位的陽性表

6、達和非目標細胞即使 陽性也不應作為判斷依據.根據抗原在細胞中 分布和陽性顆粒沉淀部位可分5種類型：, 胞膜型 陽性顆粒主要分布于細胞膜表面,形成一薄層棕黃色顆粒包繞整個細胞.此類型常見于某些膜抗原,如上皮膜抗原（EMA）、白細胞共同抗原（LCA）及B細胞、T細胞、粒細胞相關抗原（GAA）, 胞核型 陽性顆粒定位于細胞核,呈均勻分布位于核膜下,有的呈小斑塊狀不規(guī)則分布.多見增殖細胞核抗原、Ki-67及激素受體中雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和基因p53等, 胞漿型 陽性顆粒主要分布于細胞漿.大部分抗原均屬此型,如細胞角蛋白、波形蛋白、神經絲蛋白、肌紅蛋白、1-抗胰糜蛋白酶及前列腺特異性抗

7、原（PSA）等.抗原在胞漿內分布通常為彌漫性或局限性.彌漫性是陽性顆粒彌漫而均勻地分布于整個細胞漿,局限性是指陽性顆粒呈小斑點狀或斑塊狀局限于細胞漿中的某一部位、核周或細胞漿的一側, 微絨毛型 抗原顆粒主要分布于腺癌細胞的微絨毛,胞漿和胞膜可以是陽性或陰性表達.此形最常見于各種腺癌,如甲狀腺、乳腺、胃腸、膽道、卵巢漿液性腺 癌等.特點是陽性顆?？拷幻?基底部可呈陰性反應.在腫瘤標記物中多見于上皮膜抗原、上皮特異性抗原、結腸相關抗原、卵巢癌抗原等,甲狀腺腺癌中甲狀腺球蛋白常以該形式出現(xiàn), 復合型 常規(guī)免疫組化標記中,同一種抗原可以同時表達于胞膜和胞漿、胞核和胞漿、微絨毛和胞漿,很少發(fā)現(xiàn)胞膜和胞

8、核同時表達.應注意組織標本固定不及時造成抗原移位,3.陽性標記組織學特征,根據免疫組化陽性細胞的組織學特點,免疫組化陽性細胞或陽性顆?？沙室韵骂愋团帕?局灶型 彌漫型 片塊型 網狀型 腺管型 腔緣型 菊團型,4.陽性標記強度特征,細胞免疫組化標記的陽性強度根據顯色程度分為弱陽性、陽性和強陽性;也可依據陽性細胞在細胞中所占比例大致分為:弱陽性,陽性細胞25%;陽性,陽性細胞25% 50%;強陽性,陽性細胞50%,5.非特異著色特征,下面情況可干擾免疫組化結果的觀察和判斷： （1）抗體交叉反應:是由于該抗原決定簇同 時存在于多種組織細胞，如GFAP可同時存在 于星形膠質細胞和唾液腺肌上皮.S-10

9、0蛋白 則更為嚴重,可表達于多種組織細胞.因此應 全面了解和認識該抗體的功能和標記范圍,（2）腫瘤細胞異常表達:可選用多種標記證實或排除,鑒別其真正組織來源或向某一組織細胞分化 （3）腫瘤細胞吞噬組織抗原:某些惡性腫瘤細胞攝入周圍正常組織細胞成分,雖然后者也存在某些抗原,但不屬于瘤細胞固有成分,胞漿內抗原定位較模糊,因此應該區(qū)別,（4）非特異性染色:是指抗原無明確定位,細胞與間質均為黃色,相互累及一片,色度無深淺之分.常原因見為組織標本固定不佳、抗體質量問題或稀釋度不合理及操作方法不規(guī)范等.免疫組化特異性染色定位非常重要,如果缺乏細胞間的不均一性染色即使陽性染色,常提示為非特異性染色.組織片邊

10、緣反應和出血壞死灶周圍陽性反應不能作為診斷依據,免疫組化結果的判斷原則及對假陰性和假陽性的認識,免疫組化結果判斷原則 .必須設染色對照 每批染色都要以特異性陽性對照和陰性對照為基礎.沒有陽性對照 就不能做出真正陰性結果的判斷;沒有陰性 對照,也就不能做出真正陽性結果的判斷. 沒有對照的免疫組化結果是不可信的,抗原表達必須在特定部位 陽性表達必須在細胞和組織特定的抗原部位,如LCA在細胞膜上、S-100蛋白在胞漿和胞核內,不在抗原所在部位的陽性表達不能視為陽性 陰性結果不能視為抗原不表達 即陰性結果不能認為具有否定意義;陽性表達有強弱、多少之分,只有少數(shù)細胞陽性（在抗原所在部位）也要視為陽性表達

11、,引起假陰性和假陽性結果的原因,假陰性結果的原因主要是： （1）抗體已失活或濃度不當 （2）組織自溶(抗原擴散)導致抗原消失,特別 長期固定標本,應多用新鮮標本 （3）操作步驟不當,如反應時間不夠或過久、 洗脫不夠或溫度過高 （4）組織或細胞中抗原的含量很低,假陽性結果的主要原因（1）所用的抗體有交叉反應,特異性差，特 別應用多克隆抗體時更易出現(xiàn)（2）所用抗體濃度過高或染色過程中切片 干燥導致抗體與組織產生非特異性結合（3）組織或細胞中有內源性過氧化物酶、 堿性磷酸酶及生物素等產生非特異性 顯色,免疫組化操作經驗和體會,操作注意問題： 1.石蠟切片和冰凍切片均可,要注意防止脫片 2.充分消除內

12、源性過氧化酶和非特異性染色 3.PBS洗滌要充分 4.要設陰性和陽性對照 5.顯色注意底物要適量、時間要嚴格控制,6. 消除內源性生物素活性:先以 0.01%抗生物 素溶液作用切片20min7.ABC復合物應在臨用前30min配置8.ABC試劑保存溫度為4 9.抗體保存：-20 分裝凍存,或于4 常規(guī)使 用,切忌反復凍融,免疫組化常遇問題,1 .均勻的背景染色:酶-底物反應時間過長、孵育切片干燥、一抗或二抗稀釋度不夠、切片洗滌不充分、封閉用的正常血清不對 2 .部分區(qū)域背景著色:切片部分區(qū)域干燥、顯色反應物在封片介質中可溶、造成彌散 3 .部分區(qū)域不著色:脫蠟不完全 、切片部分區(qū)域干燥,4.各

13、種孵育結果所有抗體均不著色 :H2O2終濃度不夠或存放過久、稀釋液中有錯誤的正常血清、顯色反應物溶于脫水的酒精及二甲苯或封片液 5.某些抗體不著色:需要消化而沒有消化、封閉內源酶時使抗體活性下降、切片在裱片或干燥時過熱、抗體過度稀釋、一抗?jié)舛刃∮诙?、抗體過期或頻繁凍融,6. 內源性酶活性:H2O2 -甲醇封閉不當 7. 脫片:切片無粘附試劑、切片不干凈、組織 在貼片前已經充分固定 8. 核輪廓模糊:切片已干燥、蘇木素染液欠佳 9 . 非特異性染色:底物未過濾、抗體未離心 10.陽性反應太弱:抗體或其它試劑活性下降、 顯色反應時間過短、抗體的稀釋度或孵育 時間不夠、加抗體時切片上緩沖液過多,1

14、1 .切片鏡下模糊或黑點沉著:脫水不徹底、 進入二甲苯前加一步等量石碳酸/二甲苯 混合液、溫箱干燥替代脫水過程, 免疫熒光標記技術,熒光是指一個分子或原子吸收了給予的能量后,即刻引起發(fā)光,停止能量供給,發(fā)光亦瞬即停止.熒光素是一種能吸收激發(fā)光的光能產生熒光,并能作為染料使用的有機化合物,亦稱熒光色素.目前用于標記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明(RB200)及四甲基異硫氰酸羅丹明(TMRITC),FITC:最大吸收光譜490-495nm, 最大發(fā)射光譜 520-530nm，黃綠色RB200:最大吸收光譜570-575nm，最大發(fā)射 光譜595-600nm，橙紅色TMRITC

15、:最大吸收光譜550nm，最大發(fā)射光譜620nm，橙紅色,基本原理 免疫熒光技術是將抗原抗體反應的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結合,以熒光素作為標記物,與已知的抗體(或抗原)結合、不影響其免疫學特性.將熒光素標記的抗體作為標準試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原.在熒光顯微鏡下,可以直接觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復合物及其存在部位,熒光抗體染色方法 直接法:這是熒光抗體技術最簡單和基本的方法.滴加熒光抗體于待檢標本片上,經反應和洗滌后在熒光顯微鏡下觀察.標本中如有相應抗原存在,即與熒光抗體特異結合,在鏡下可見有熒光的抗原抗體復合物.此法的優(yōu)點是簡單、特異.但其缺點是檢查每種抗原均需制備相應的特

16、異性熒光抗體,且敏感性低于間接法,間接法:首先將待測抗體加在含有已知抗原的標本片上作用一定時間沖洗;滴加標記抗抗體.如第一步中抗原抗體發(fā)生結合,加入的標記抗抗體和已固定在抗原上的抗體分子結合,形成抗原-抗體-標記抗抗體復合物并顯示熒光.此法優(yōu)點是敏感性高于直接法,缺點容易產生非特異性熒光,免疫熒光實驗的注意事項 1.反應過程一定要避光,操作過程盡量避光 2.操作過程結束,盡快熒光顯微鏡下看結果 3.注意鏡下結合熒光與非結合熒光的區(qū)別 4.每次實驗應該提前激發(fā)熒光顯微鏡光源 5.使用熒光顯微鏡時間1-2h為宜, 熒光原位雜交（FISH）技術,熒光原位雜交（Fluorescence in situ

17、 hybridization，F(xiàn)ISH）是建立在核酸分 子雜交和放射性原位雜交基礎上的非放 射性原位雜交技術，將標記的核酸探針 與細胞或組織中的核酸進行雜交,它是基于DNA探針序列與標本細胞中互補序列的特異堿基配對的原理,DNA探針經引入報道分子（如生物素或地高辛）的化學修飾后，可利用與特異報道分子結合物（如親和素或直接抗報道分子的抗體）偶聯(lián)的熒光染料加以檢測。FISH技術可用于染色體的DNA檢測、基因定位、轉基因檢測、染色體異常觀測及疾病的診斷等眾多領域,染色體熒光原位雜交始于細胞遺傳學和DNA技術的結合,基礎為Southern blot原理,以半抗原如生物素、地高辛間接標記或以熒光素直接標

18、記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交,互補的異源單鏈DNA 分子在適宜的溫度和離子強度下退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈DNA,通過熒光標記在通過熒光顯微鏡觀察雜交信號,熒光原位雜交優(yōu)點 1. 快速靈敏、特異性好,可同時分析分裂期 和間期的多個細胞,并進行定量 2. 檢測隱匿或微小的染色體畸變以及復雜核 型 3. 使用多種熒光標記,顯示DNA片段及基因 之間的相對位置與方向,空間定位精確,熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交實驗流程, 分光光度法,分光光度法是通過測定待測物質在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度， 對該物質進行定性和定量分析的方法, 此法主要用于核酸和蛋白質的定量檢

19、測,分光光度法常見用途： 1.核酸的定量 是分光光度計使用頻率最高的功能.可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA以及RNA.最高吸收峰的吸收波長260 nm 2.蛋白質定量,染料結合比色法：在酸性條件下，考馬斯亮蘭 G-250 可通過疏水基與蛋白質分子的側鏈基團結合呈蘭色,在465595nm(最大吸收峰),隨蛋白質含量不同，顏色在紫色到蘭色之間變化，在一定范圍內吸收值的大小與蛋白質濃度呈直線關系。,操作:取待測蛋白質樣品0.1ml(100-1000 ug/ ml);加入稀釋的顯色劑5ml混勻室溫10 min顯色,測定其在595 nm的吸光度值(60 min內完成),制作標準曲線(1-10 ug),根據標準曲線求出待測樣品蛋白質含量,常用的波