1、14 第十一章 種質(zhì)保存,第一節(jié) 種質(zhì)保存的方法,1、種質(zhì)（germplasm）： 指親代通過生殖細胞或體細胞傳遞給子代的遺傳物質(zhì)。 植物的各種栽培品種及原始品種，構(gòu)成了豐富的種質(zhì)庫，對植物育種是個無價之寶，同時保存生物遺傳的多樣性對人類的生存和發(fā)展有極為重要的意義。 目前，這些植物的存在正受到不斷引進的新品種的排擠，遺傳資源受到變異及瀕臨滅絕的危險。 為了保證對栽培植物遺傳資源搜集、保存和評價，并能使世界上任何地方的育種家都可能利用，在1974年建立了一個全球性遺傳資源中心網(wǎng)，由國際農(nóng)業(yè)研究顧問組織決定建立植物遺傳資源國際委員會。負責(zé)對全球植物種質(zhì)資源的保存。,組織培養(yǎng)保存種質(zhì)的優(yōu)點： 占用

2、空間小，可保存大量的無性系，即所謂的營養(yǎng)體種子(vegetative seed)。傳統(tǒng)種質(zhì)是以種子的形式保存，不過這種方法有局限性，隨著貯存時間的延長，種子的生活力下降。 離體培養(yǎng)保存種質(zhì)，不會受到病蟲害侵染以及不良環(huán)境影響。在苗圃或田間大量保存各種植物基因型，不但成本極高，而且還受到天災(zāi)毀滅的危險。 特定條件下，不需對保存材料進行修剪、耕作措施。 由于組培材料不帶病毒或病原菌，有利于克隆材料進行地區(qū)及國際間交換。,2、種質(zhì)保存的方法,(一）抑制生長保存 在正常條件下的組織培養(yǎng)不適合種質(zhì)保存。因為在這種條件下，材料生長很快，需經(jīng)常進行轉(zhuǎn)接。不僅使保存工作量加大費用升高，也導(dǎo)致在轉(zhuǎn)接中污染和由取

3、樣的隨機性造成基因資源的丟失。 因此，理想的保存方法是使培養(yǎng)物處于無生長或緩慢生長狀態(tài)下抑制植物的生長，減少繼代次數(shù)，達到長期保存目的。需要時可以迅速恢復(fù)正常生長。抑制生長的外植體可以是莖段、莖尖及愈傷組織。,低溫保存 抑制生長的最常用手段是降低溫度。一般作物對低溫的耐受力與它們的起源和最適生長的生態(tài)條件有關(guān)。 如熱帶作物對低溫的耐受力不如溫帶作物。馬鈴薯、蘋果、草莓及大多數(shù)草本植物可以在06條件下保存，而木薯、甘薯的保存溫度不能低于1520。 種質(zhì)外植體材料在非凍結(jié)的低溫下，老化程度減慢，因而導(dǎo)致繼代間隔的時間延長。,低壓保存法： 低氣壓方法： 通過降低培養(yǎng)物周圍的大氣壓而起作用，其結(jié)果是降

4、低了所有氣體分壓，使培養(yǎng)物的生長速度降低。 低氧壓方法： 低氧系統(tǒng)是在正常氣壓下，加進氮氣等惰性氣體，使其中氧分壓降低到較低水平，從而達到抑制生長的目的。 采用這兩種方法對不同組織器官和物種都取得了良好效果。,（3）生長抑制劑 在培養(yǎng)基上加入生長抑制劑也能有效地減緩植株生長。 李維等（1993）利用B9和CCC使葡萄試管苗繼代頻率由3月1次，變?yōu)?年1次。多效唑可使小麥和馬鈴薯的轉(zhuǎn)管速度降低，同時使試管苗移栽成活率提高。 抑制劑不僅使生長延緩，苗粗狀，也有利于移栽。 （4）高滲透壓法： 提高培養(yǎng)基的滲透壓，來抑制植物的生長。 可以提高蔗糖、山梨醇、甘露醇或瓊脂濃度來提高滲透壓。,（5）干燥保存

5、法,對培養(yǎng)材料進行干燥處理，脫水，延緩其生長。 （二）超低溫保存種質(zhì) 離體材料經(jīng)過處理后，在超低溫（-196 液氮LN中）條 件下保存的過程。 原理：在液氮中植物細胞與組織的代謝活動停止、不發(fā)生遺傳變異，當(dāng)解凍后，細胞重新恢復(fù)生長能力。 超低溫保存的五個步驟： 預(yù)處理-冷凍-貯存-解凍-重新培養(yǎng),1）預(yù)處理：,目的：使材料適應(yīng)將要遇到的低溫，提高自由水含量低的新細胞的生成，避免冷凍過程中細胞內(nèi)大的冰晶的形成，提高細胞的成活率。 方法： 低溫預(yù)處理：低溫鍛煉 添加冷凍防護劑：提高溶液的粘滯性，防止細胞內(nèi)大的 冰晶形成。 5-8% 二甲基亞砜（DMSO)、甘油、10%脯氨酸。,2）冷凍處理：,慢凍

6、法：以1-5/min，降溫到-30 左右，平衡1h后，放 入液氮中保存。 快凍法：短時間內(nèi)迅速降溫，在液氮中保存。 預(yù)凍法：溫度逐漸呈梯度下降，然后超低溫冷凍。 干凍法：首先脫水（烘干或抽真空），然后液氮保存。,3）冷凍貯存：,注意補充定期液氮、貯存時間。 4）解凍： 快解凍：迅速放到35-40 的溫水浴中解凍，使冰晶溶 化，對細胞傷害小。 慢解凍: 材料在0-3 的條件下，緩慢解凍。 5）重新培養(yǎng)： 抗凍保護劑的洗滌： 成活率的提高：,實例：冷凍保存玉米懸浮培養(yǎng)細胞的程序,1、用添加10%脯氨酸的新鮮培養(yǎng)基將活躍生長的懸浮培養(yǎng)物繼代培養(yǎng)。 2、3-4天后，以不含脯氨酸的培養(yǎng)基把細胞洗凈，重新懸浮培養(yǎng)。 3、把含有20%脯氨酸的冷培養(yǎng)基加入等量懸浮培養(yǎng)液中，分4份，在1小時內(nèi)逐漸加入。 4、在可控冷凍器中，以1 /min的速度冷卻到-30 。并平衡30-40min. 5、放到液氮中保存。 6、化凍時，投入40 水浴中，攪動1-2min. 7、