1、1,纖維素酶類糖苷水解酶及其降解機(jī)理,第四章,2,4.1 導(dǎo)言,纖維素類生物質(zhì)是自然界中最豐富的。與淀粉在結(jié)構(gòu)上的差別僅在于糖苷鍵連接方式不同。 多與半纖維素、木素相互結(jié)合在一起。 纖維素酶系統(tǒng) 非復(fù)合：真菌、放線菌 一般由菌絲分泌到胞外分別發(fā)揮作用。 復(fù)合： 厭氧菌（熱纖梭菌） 在其細(xì)胞壁上產(chǎn)生隆起的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，為纖維小體。,3,自從 1906年在蝸牛消化液中首次發(fā)現(xiàn)纖維素酶后，人類對其研究經(jīng)歷了百年歷史： 1950-木酶的發(fā)現(xiàn)，C1-Cx假說。 1980 年至 1988 年-利用基因工程的方法對纖維素酶的基因進(jìn)行克隆和一級結(jié)構(gòu)的測定。 90年代-厭氧細(xì)菌纖維小體超分子復(fù)合體結(jié)構(gòu)功能研究，多結(jié)

2、構(gòu)與體系的發(fā)現(xiàn)。 21世紀(jì)-基因及氨基酸序列，分子時代。,導(dǎo)言,4,4.2 纖維素酶系統(tǒng)的組成,根據(jù)各酶的功能可分為三大類： (1)內(nèi)切葡聚糖酶（endo-1,4-Dglucanase,EC.,來自真菌的簡稱 EG ，來自細(xì)菌的簡稱Cen）,這類酶作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解 -1，4-糖苷鍵,將長鏈纖維分子截斷,產(chǎn)生大量非還原性末端的小分子纖維素。,(2)外切葡聚糖酶(exo-1，4-D-glucanase，EC.1，又稱纖維二糖水解酶，來自真菌簡稱CBH，來自細(xì)菌簡稱Cex。）這類酶作用于纖維素分子的非還原端,依次水解 -1,4-糖苷鍵,每次切下一個

3、纖維二糖分子。,5,(3)-葡萄糖苷酶(-glucosidase,EC.1,簡稱 BG）,這類酶水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖。對纖維二糖和纖維三糖的水解很快，隨著葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。,4.2 纖維素酶系統(tǒng)的組成,6,4.3 糖苷水解酶家族,以底物專一性為基礎(chǔ)建立的命名方法不能反映酶分子的結(jié)構(gòu)特性。 把作用于碳水化合物的相關(guān)酶類分成許多蛋白質(zhì)家族，形成專門的數(shù)據(jù)庫共享。 碳水化合物活性酶 (CAZy)分類系統(tǒng)，只對結(jié)構(gòu)域進(jìn)行定義。 CAZy中某一基因的結(jié)構(gòu)域以模塊表示。,7,8,9,圖4.2,10,4.4厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)

4、構(gòu)與功能,厭氧細(xì)菌在纖維素底物上生長時，在細(xì)胞壁上產(chǎn)生隆起的細(xì)胞結(jié)構(gòu)即為纖維小體。 不同生物體之間纖維小體結(jié)構(gòu)相似，但其組成成分隨著種的不同而有所差異。 纖維小體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、體積龐大、異質(zhì)性強(qiáng)。,11,4.4.1 纖維小體的一般組裝模式,結(jié)構(gòu)蛋白：初級腳手架蛋白，錨定腳手架蛋白等 催化模塊：纖維素酶、半纖維素酶等,12,4.4.1 纖維小體的一般組裝模式,對接模塊,粘連模塊,13,4.4.1 纖維小體的一般組裝模式,14,4.4.2 粘連模塊與對接模塊, 粘連模塊 不同厭氧微生物的粘連模塊序列差異很大。 同一個腳手架蛋白上的粘連模塊一般為同一類型，不同粘連模塊之間有不同的序列相似性

5、。 目前型和型粘連模塊晶體結(jié)構(gòu)已測定。,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,15,16,對接模塊,由大約具22個氨基酸的兩條重復(fù)序列組成 鈣離子促使對接模塊折疊，并使其形成穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)。也是粘連模塊-對接模塊相互作用所必需的。 對接模塊與其相應(yīng)的粘連模塊的分支情況相對應(yīng)。,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,17,18,粘連模塊和對接模塊相互作用,決定了纖維小體的結(jié)構(gòu)，并纖維小體各亞基的整合僅依 賴于此。 主要以疏水作用相聯(lián)系，并輔以相對較少的分子間氫鍵。 熱纖梭菌中型粘連模塊與對接模塊的相互作用是目前已知最強(qiáng)的蛋白質(zhì)間相互作用之一。,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,19,粘連

6、模塊與酶上對接模塊在種內(nèi)的結(jié)合是非專一性的，而在種間的相互作用卻是專一性的。生化水平上，包含對接模塊的酶與包含粘連模塊的腳手架間的結(jié)合本質(zhì)上是非特異性的。 對接過程中粘連模塊總體結(jié)構(gòu)本質(zhì)上不變，對接模塊發(fā)生了構(gòu)象變化。,粘連模塊和對接模塊相互作用,20,圖4.4 熱纖梭菌型粘連模塊紅色和型對接模塊藍(lán)色相互作用示意圖,21,4.4.3 纖維小體上的催化模塊,以熱纖梭菌為例，它既有纖維小體酶系，也有游離的非纖維小體酶。區(qū)別纖維小體酶與游離酶的關(guān)鍵特征是，纖維小體酶帶有對接模塊 。 催化模式具有多種情況：熱纖梭菌中，表現(xiàn)為葡聚糖內(nèi)切酶活性、持續(xù)降解的纖維素內(nèi)切酶活性、纖維素外切酶。,厭

7、氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,22,典型的纖維小體外切酶（或持續(xù)性內(nèi)切酶）的空間結(jié)構(gòu),厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,23,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,典型的纖維小體內(nèi)切酶的空間結(jié)構(gòu),Figure 4.4.3 Structural comparison of (/)6 glycosyl hydrolases,24,根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)的相似度，CBM可被分成不同的家族。不同纖維小體家族中按功能分主要屬于A型和B型。 腳手架上的CBM,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,4.4.4 碳水化合物結(jié)合模塊CBM （carbohydrate-binding module)

8、,圖4.4 熱纖梭菌腳手架蛋白上的CBM結(jié)構(gòu)示意圖,腳手架蛋白上往往包含一個CBM，它被認(rèn)為負(fù)責(zé)將多酶復(fù)合體錨定在相應(yīng)底物上（雖然在瘤胃球菌的纖維小體中沒有發(fā)現(xiàn)）,其屬于A型。 熱纖梭菌腳手架蛋白CBM的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為一個由9個片層組成的果凍卷。,25,酶上的CBM不是保持酶復(fù)合體接近底物表面所必需的結(jié)構(gòu)。然而其具有潛在的功能，似乎是單個酶專一性結(jié)合底物，特別是其在分子水平上結(jié)合單個底物分子鏈（如可溶性的- 葡聚糖或木聚糖鏈）。 酶分子模塊上的CBM既有A型也有B型。,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,酶分子的CBM,26,纖維小體和游離酶上的CBM比較

9、,CBM蛋白質(zhì)的種類及其所屬家族都是高度不同的。 但部分在纖維小體和游離催化系統(tǒng)中是相同的。 有些只存在于游離催化系統(tǒng)，而在纖維小體中完全不存在。,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,27, 影響小體與底物結(jié)合的因素,弱離子強(qiáng)度能抑制纖維小體結(jié)合纖維素。 水分子能夠從纖維素基質(zhì)中釋放至少部分的纖維小體或CBM。 適當(dāng)增加溶液中的鹽含量可提高纖維小體對底物的親和能力。 吸附底物次優(yōu)條件下，纖維小體復(fù)合體的酶活力最高。,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,28,4.4.5纖維小體的多樣性,根據(jù)纖維小體上腳手架蛋白的數(shù)量，可以被分為兩類: 第一類：解纖維梭菌、食纖維梭菌、約氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、等

10、嗜溫梭菌產(chǎn)生的纖維小體。只發(fā)現(xiàn)了型的粘連模塊和對接模塊。（69個） 第二類：熱纖梭菌、解纖維醋弧菌、黃色瘤胃球菌和溶纖維素擬桿菌。復(fù)雜程度高。 有限資料表明，纖維小體的組成和分布會受到碳源的影響，另外纖維小體的某些結(jié)構(gòu)蛋白和催化組分基因的表達(dá)也受到生長速率的影響。,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,29,圖4.5,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,4.4.5纖維小體的多樣性,30,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,4.4.5纖維小體的多樣性,31,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,4.4.5纖維小體的多樣性,32,4.4.6 纖維小體基因在基因中的分布規(guī)律,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,33,4.4.7 微型

11、人造小體的研究進(jìn)展,纖維小體實際上是一個微型而高效的纖維素降解機(jī)器。現(xiàn)在已提出了通過理性人工設(shè)計并通過工程手段提高天然纖維小體降解活力的新思路 。 可行性依據(jù)： 1）對于細(xì)菌的粘連模塊和對接模塊，無論是單獨生成還是移植到異源性的蛋白質(zhì)上，它們都能忠實地保持自身的生物學(xué)性質(zhì)。 2）二者高親和力相互作用在一些產(chǎn)纖維小體的細(xì)菌種類之間具有物種專一性。,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,34,與天然纖維小體相比，有三個主要的不同之處： 1）含有酶的數(shù)量有限。 2）是同源性的。 3）每個酶在微型手腳架蛋白上的位置是受到控制的。 未來前景包括構(gòu)建新的雜交手腳架蛋白，使之能夠?qū)⑷齻€或多個不同的酶結(jié)合到特定位點上

12、。嵌合體的穩(wěn)定性也是影響它將來工業(yè)化應(yīng)用的一個因素。,厭氧細(xì)菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,4.4.7 微型人造小體的研究進(jìn)展,35,4.5好氧真菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,好氧真菌分泌的纖維素酶分子一般都由一個糖基化的連接肽將一個較大的催化結(jié)構(gòu)域和較小的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接起來構(gòu)成。,36,4.5.1 催化結(jié)構(gòu)域及催化斷鍵機(jī)理,纖維素酶催化斷鍵功能相似，但屬不同糖苷水解酶家族。 T.reesei是纖維素酶體系研究最為深入的好氧真菌。其中CBH I是該菌所產(chǎn)主要的外切酶。 催化中葡聚糖異頭碳的構(gòu)型并不發(fā)生變化。 水解主要產(chǎn)物是纖維二糖。,好氧真菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,37,好氧真菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,4

13、.5.1 催化結(jié)構(gòu)域及催化斷鍵機(jī)理,38,圖4.9,好氧真菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,39,有待研究的問題： 1.結(jié)晶纖維素表面如何游離出單根葡聚糖分子鏈。 2.單根葡聚糖鏈如何快速準(zhǔn)確地進(jìn)入CBH的催化孔道中。 3.葡聚糖鏈如何在催化孔道中高效地持續(xù)性單方向運動。,4.5.1 催化結(jié)構(gòu)域及催化斷鍵機(jī)理,好氧真菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,40,4.5.2 纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)與的結(jié)構(gòu)與功能,好氧真菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,當(dāng)多個不同蛋白質(zhì)中都存在一個相同或相似的結(jié)構(gòu)域時，該結(jié)構(gòu)域稱之為模塊。每一纖維素酶分子包含催化模塊和碳水化合物模塊（CBM）。 基于結(jié)構(gòu)和功能，將不同CBM分成三類：,41,好氧真菌纖維素酶

14、的結(jié)構(gòu)與功能,4.5.2 纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)與的結(jié)構(gòu)與功能,42,CBM的功能 推測其功能是將催化結(jié)構(gòu)域拉近到不溶性的纖維表面，使纖維素水解過程易于進(jìn)行。但是其功能及催化中的分子機(jī)理仍未形成共識。,好氧真菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,4.5.2 纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)與的結(jié)構(gòu)與功能,43,4.5.3 鏈接區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能,好氧真菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,纖維素酶的模塊結(jié)構(gòu)通常由韌性的糖基化連接區(qū)連接在一起。 其有效長度及柔韌性也是酶催化過程的關(guān)鍵。 富含脯氨酸、蘇氨酸和甘氨酸。,44,4.5.3 鏈接區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能,好氧真菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能,雖然許多結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)已得到解析，但目前還沒有一個包含完整纖維素酶的三

15、維結(jié)構(gòu)獲得解析。,45,4.6 纖維素酶持續(xù)性降解結(jié)晶纖維素 的動態(tài)催化過程,結(jié)晶纖維素的降解是纖維素降解的關(guān)鍵限速步驟。持續(xù)性作用的外切纖維素酶是降解結(jié)晶纖維素的主要酶類。 可分為兩個過程： 纖維素結(jié)晶超分子結(jié)構(gòu)的破壞。（需外加能量） 糖苷鍵的斷裂。（為酶催化反應(yīng)，是動力學(xué)過程）,46,4.6.1 纖維素酶分子-底物之間的結(jié)合過程,纖維素酶通過結(jié)合結(jié)構(gòu)域吸附到底物上； 定位于底物表面上特定的化學(xué)鍵上； 形成酶-底物復(fù)合物； -糖苷鍵的水解，同時酶分子沿著纖維素鏈前進(jìn)； 纖維素酶從底物脫吸附，或重復(fù)第4步，當(dāng)催化結(jié)構(gòu)域離開纖維素鏈時重復(fù)第2、3步； -葡萄糖苷酶水解纖維二糖形成葡萄糖。 反應(yīng)過

16、程存在產(chǎn)物的抑制，及底物結(jié)構(gòu)變化對酶分子催化過程的影響等因素。,纖維素酶持續(xù)性降解結(jié)晶纖維素的動態(tài)催化過程,47,4.6.2 外切纖維素酶對底物分子的催化斷鍵過程, 酶分子-底物復(fù)合物 待酶分子與底物結(jié)合構(gòu)象變化形成穩(wěn)定復(fù)合物后，催化斷鍵是瞬間發(fā)生。一般通過分子動力學(xué)/量子力學(xué)(MM/QM)，的方法進(jìn)行研究。 對外切纖維素酶CBH I 的分子動力學(xué)模擬，CBH I 的催化孔道與糖鏈之間有分子間氫鍵作用，糖分子所有的羥基與各種氨基酸殘基相互作用，起到穩(wěn)定酶-底物復(fù)合物的作用。,纖維素酶持續(xù)性降解結(jié)晶纖維素的動態(tài)催化過程,48, 共價糖基-酶中間體的形成 催化循環(huán)的第一

17、步,纖維素酶持續(xù)性降解結(jié)晶纖維素的動態(tài)催化過程,4.6.2 外切纖維素酶對底物分子的催化斷鍵過程,49, 異頭碳的恢復(fù),纖維素酶持續(xù)性降解結(jié)晶纖維素的動態(tài)催化過程,50, 異頭碳的恢復(fù),纖維素酶持續(xù)性降解結(jié)晶纖維素的動態(tài)催化過程,51,4.6.3 外切纖維素酶催化降解結(jié)晶纖維素的分子內(nèi)協(xié)同模型,CBH I的兩結(jié)構(gòu)域(CD與CBM)作用的分子內(nèi)協(xié)同模型。,纖維素酶持續(xù)性降解結(jié)晶纖維素的動態(tài)催化過程,內(nèi)切酶,外切酶CBM,外切酶催化結(jié)構(gòu)域,52,4.6.4 外切纖維素酶持續(xù)性催化過程動力從何而來,分子動態(tài)學(xué)指出，大分子的動態(tài)行為與其功能密切相關(guān)。 新的酶學(xué)研究認(rèn)為酶分子執(zhí)行功能時要完成一系列構(gòu)象變