1、放射性 核素標記物,被測物(antigen),特異結合試劑： 抗體(antibody) 特異結合球蛋白 受體蛋白 酶、微生物,競爭性 結合,被測物,標記的特異 結合試劑 （抗體）,非競爭性 結合,Non-competitive binding,RIA (Radioimmunoassay),要求： 掌握原理 把握特點 熟悉設計思想 了解計算方法,第四章 體外放射分析第一節(jié) 放射免疫分析,131I-胰島素,抗胰島素抗體,內源性胰島素,高,低,負相關,兔和人血中的胰島素量,諾貝爾 生物醫(yī)學獎,Berson,Yalou,一、放射免疫分析原理,放射性核素標記的抗原 限量的抗體 被測抗原（或其標準品） 放

2、射性復合物的放射性 逆相關 被測抗原的含量,1競爭結合的反應機制,Ag,Ab,+,Ag - Ab,非標記復合物,+,*Ag,一定量,不定量,限量,*Ag-Ab,標記復合物,4,8,4,0,0,8,2,2,24,1,3,B,?,2*Ag一Ab的放射性 與Ag間的逆相關有數(shù)學基礎,Po： 標記物加待測物的初始濃度 Qo： 特異性結合試劑的初始濃度 B： 標記復合物占總放射性的百分數(shù) F： 游離標記物占總放射性的百分數(shù) R = B/F B + F = 1 Ag-Ab = PQ, Ag = P,B + F = 1,B B 1-F PQ R = = = = F 1-B F P R 1 B = , F =

3、 1+R 1+R PoR PQ = PoB = = Po (1-F) 1+R,PQ = R(Po-PQ) = RPo - RPQ,PQ + RPQ = RPo,PQ(1+R) = RPo,PoR PQ = - = PoB 1+R,B Ag-Ab Ag-Ab PQ R = = = = F Ag Po-Ag-Ab Po-PQ,P + Q PQ PQ PQ K = = (4-1) P Q P(Qo - PQ), B與Po的函數(shù)關系, F與Po的函數(shù)關系, R與Po的函數(shù)關系,Bx,?,800,750,25.4,46.7,3劑量反應曲線(dose response curve) 是定量依據,二、劑量反

4、應曲線,1. 標準曲線斜率對定量測定的影響,甲,乙,2. 影響劑量反應曲線斜率的常見因素,(1) 反應試劑,1)抗體的親和力,2) 抗原的用量,P + Q PQ,109L/mol,PQ K = - P Q,3) 標準抗原的免疫活性,) 標記抗原的放射性比活度與放射化學純度,3.7GBq/mg(0.1Ci/mg) 370GBq/mmol(10Ci/mmol),95%,NSB,5) 抗體的用量,5) 抗體的用量,B=33%50%,P非標記趨于零,Po 約等于P標記,P標記4/K,P 標記趨于零,B = 0.33(33%),P標記 = 4/K,B=0.5(50%),(2) 反應方式 (3) 反應條件

5、,放射免疫分析的特點,1. 靈敏度高 檢出極限為10-910-12 g / ml, 甚至可達10-15 /ml 2. 特異性強 能識別立體異構體（T3,T4,反T3） 3. 應用范圍廣：國外（300）,國內（100） 4. 操作簡便: 試劑盒，樣品不需純化,放射免疫分析的缺點,1. 易引起誤差：生物試劑 2. 時間長：溫育 3. 難于超過10-15g / ml：TSH 4. 與生物活性不一定相關：免疫反應,放射免疫分析的基本流程 加樣 溫育 分離 測B或/和F的放射性計數(shù) 繪制劑量反應曲線 求待測抗原的含量(濃度) 簽發(fā)檢測報告,三 放 射 免 疫 分 析 方 法 學,RIA的方法必需具有的條

6、件, 符合一定質量要求的標記抗原 高質量的抗體 高純度的標準抗原 合適的游離抗原和抗原抗體復 合物的分離方法,. 基 本 的 反 應 試 劑,（ ） 標 準 抗 原,標 準 抗 原 指 具 有 已 知 真 實 含 量 ， 且 不 含 對 免 疫反 應 產生 干 擾 雜 質 的 抗 原。, ） 標 準 抗 原 在 中 的 用 途, 制 備 抗 體 制 備 標 記 的 抗 原 繪 制 劑 量 反 應 曲 線,2 ） 對 標 準 抗 原 的 基 本 要 求, 標準抗原與待測抗原免疫性必須一致 標準抗原必須高純度 結構純、化學純 標準抗原的量必須準確 稱 量 、 溶 解 、 稀 釋 、 取 樣 標準抗

7、原應有很好的穩(wěn)定性 避免反復凍融、小量分裝保存、平行實驗,1,2,3,4,5,倍 比 稀 釋 法,1,2,3,4,5,倍 比 稀 釋 法,1,2,3,4,5,倍 比 稀 釋 法,1,2,3,4,5,倍 比 稀 釋 法,100g/ml,（） 抗 血 清(antiserum),PQ PQ K =- = - (4-1) P Q P(Qo - PQ) B/F = KQo - K PQ (Scatchard方程) 斜率b = -K, PQ = Ag-Ab + *Ag-Ab PQ = B% Po,）親和常數(shù),示例：求抗胰島素血清的值,經稀釋的抗胰島素血清每管加入.1ml ，標記胰島素的比放射性為7.4ug

8、，每管加入 .1（. g），標準胰島素的各管濃度見表-1，每管.1ml。總反應體積為0.3ml。,(B%)i = B/T100% , (B/F)i = B/T-B, PQi = (B%)i Poi, 直線延長法 b = Y/X=K = 1.105/2.6610-11 = 4.151010L/mol,1.105,2.6610-11, 直線回歸法 y = 1.1175 - 0.42611011 x,y=a+bx B/F=KQo+KPQ,K=1091012L/mol B/F K=Y/X=- PQ (mol/L),） 交 叉 反 應 率 (cross reaction rate),Y 50pg 交叉反

9、應率 = - = - 100% = 0.5% X 10000pg,3) 抗 血 清 的 滴 度 指在無標準抗原 存在時，結合50%標 記抗原時抗血清的稀 釋度。,滴度增加 靈敏度提高， 可測范圍縮小 滴度減少 靈敏度下降， 可測范圍擴大,（） 標 記 抗 原,基本概念： 在抗原的分子中，有一個或兩個原子被放射性核素所取代的抗原，稱為標記抗原。,（） 標 記 抗 原,要 求 標 記 抗 原 的 免 疫 活 性 與 被 測抗 原 （ 及 其 標 準 品 ） 一 致, 要 有 適 當 高 的 放 射 性 比 活 度 和 放 射 化 學 純 度,3H: 1.08TBq/mmol(29.2Ci/mmol

10、) 125I:80.7TBq/mmol(2180Ci/mmol),1）對 標 記 抗 原 的 基 本 要 求,） 標 記 抗 原免疫 活 性 檢 驗, 劑 量 反 應 曲線 比 較 法 抗 血 清 稀 釋曲 線 比 較 法 最 大 結 合 百 分 率 測 定 法,復合物的放射性 （Bo%）= - 100% 參與反應的標 記抗原的放射性,2. 分 離 結 合 與 游 離 物 的 常 用 方 法 （1）非 特 異 分 離 方 法,1）吸 附 法,蛋 白 質 葡 聚 糖 右 旋 醣酐,活 性 炭,2. 分 離 結 合 與 游 離 物 的 常 用 方 法 （1）非 特 異 分 離 方 法,2）沉 淀

11、法, % 飽和濃度的（4 ）2S ,聚 乙 二 醇 （ 簡 稱 ）,游離物,復合物,2. 分 離 結 合 與 游 離 物 的 常 用 方 法 （1）非 特 異 分 離 方 法 3）抽 濾 法,2. 分 離 結 合 與 游 離 物 的 常 用 方 法 （2） 特 異性 分 離 方 法 1）雙 抗 體 法,家 兔 豚 鼠,羊 、 馬,2. 分 離 結 合 與 游 離 物 的 常 用 方 法 （2） 特 異性 分 離 方 法 2）固相 抗 體 法,塑 料 纖維素 凝 膠 顆 粒 多 孔 玻 璃 微 球,2. 分 離 結 合 與 游 離 物 的 常 用 方 法 （2） 特 異性 分 離 方 法 ）葡萄

12、球菌蛋白（）沉淀法,金 黃 葡 萄 球 菌,Fc片段,IgG,Ag-Ab1,Ab2,2.分離結合與游離物的常用方法 （1）非特異分離方法 1）吸附法 2）沉淀法 3）抽濾法 （2）特異性分離方法 1）雙抗體法 2）固相抗體法 3）葡萄球菌A蛋白(SPA)沉淀法,分離方式 NSB 簡便快速 重復性 適用范圍 吸附法 F + 小分子 過濾法 B + 沉淀法 B + 雙抗法 B - 好 固相法 B + 差 A蛋白法 B + 好,分離B和F的方法比較,3. RIA 的反應方式與加樣程序,(1)平衡法 (2)順序加樣法 (3)一天法,Ag,Ab,*Ag,Ag,Ab,*Ag,.放射免疫分析方法設計,RIA

13、的方法設計內容: 標記物 抗體 標準品 緩沖液 保溫條件 分離B和F的方法,.放射免疫分析方法設計 (1) 標記抗原與抗體用量選擇 ）標記抗原用量選擇,統(tǒng)計誤差 最低計數(shù)率 抗原的用量,放射性測量統(tǒng)計誤差 5%,最低記數(shù)率500cpm,10%標記Ag,500/10% = 5000 (cpm),.放射免疫分析方法設計 (1) 標記抗原與抗體用量選擇 尋找標記抗原的“減弱濃度”法,用不同濃 度的標記抗原 分別與系列稀 釋度的抗血清 反應 ，即在同 一坐標系統(tǒng)繪 制多條抗血清 稀釋曲線 。,（ ） 曲 線 工 作 范 圍 設 計,下限值確定: 標記抗原用量 （化學量）相當 上限值確定： 繪制B/Bo

14、-log D 劑量反應曲線 高濃度段趁于水平 設置個劑量,標記抗原用量 抗血清稀釋度,標記抗 原用量 抗血清 稀釋度,曲 線 工 作 范 圍,樣品濃度低,樣品濃度高,（） 反 應 介 質,（ ） 反應的容積、溫度及時間,PH7.5 , 離 子 強 度: 0.050.1mol/L,1 ) 反 應 容 積: 0.31.2ml,） 反 應 溫 度 與 時 間,被 測 抗 原 含 量 高：1537oC 被 測 抗 原 含 量 低: 4oC,（5）B與F分 離 方 法 選 擇,方法選擇 1. PEG 法 2. 雙 抗 體 法 3. PEG+雙 抗 體 聯(lián)合,第二抗體滴度選擇 最大結合率所對 應的稀釋度作

15、為第二 抗體的滴度。,（6）樣 品采 集 與 保 存,第七章 體外放射分析的數(shù)據處理與實驗室質量管理第二節(jié) 實驗室管理概述,一、質量管理基本定義 （一）臨床實驗室定義、功能和作用 1.定義：臨床實驗室是指對取自人體的各種標本進行生物學、微生物學、免疫學、化學、血液免疫學、血液學、生物物理學、細胞學等檢驗，并為臨床提供醫(yī)學檢驗服務的實驗室。,第七章 體外放射分析的數(shù)據處理與實驗室質量管理第二節(jié) 實驗室管理概述,一、質量管理基本定義 （一）臨床實驗室定義、功能和作用 2.功能和作用：在受控情況下，以科學方式收集、處理和分析血液、體液或其他標本，在疾病的診斷、篩查、監(jiān)測過程中，觀察患者對治療效果的反

16、映，提供有益的參考信息。,第七章 體外放射分析的數(shù)據處理與實驗室質量管理第二節(jié) 實驗室管理概述,（二）質量與質量管理 1.質量：是指一組固有特性滿足要求的程度。,第七章 體外放射分析的數(shù)據處理與實驗室質量管理第二節(jié) 實驗室管理概述,（二）質量與質量管理 2.質量管理 （1）質量控制：是利用科學的方法對測定結果實行控制, 以達到規(guī)定的質量標準。,第七章 體外放射分析的數(shù)據處理與實驗室質量管理第二節(jié) 實驗室管理概述,（二）質量與質量管理 2.質量管理 （2）質量保證：提供的質量要求會得到滿足的信任。,第七章 體外放射分析的數(shù)據處理與實驗室質量管理第二節(jié) 實驗室管理概述,（二）質量與質量管理 2.質

17、量管理 （3）質量體系：為達到質量目的，根據系統(tǒng)學原理，研究各項要求的相互聯(lián)系和相互制約的關系，以整體優(yōu)化的要求處理好各項質量活動的協(xié)調和配合。,第七章 體外放射分析的數(shù)據處理與實驗室質量管理第二節(jié) 實驗室管理概述,（二）質量與質量管理 2.質量管理 （4）質量管理：確定質量方針、目標和職責,在質量體系中通過諸如：質量和策劃、質量控制、質量保證和質量改進，使其實施的全部管理職能的所有活動。,二、實驗室誤差分類及來源,（一） 誤差及其分類 誤 差： 實 際 測 定 的 值 與 公 認 的 “ 真 值 ” 之 間 存 在 的 差 異 稱 為 測 定 誤 差 。,誤差分類,.系統(tǒng)誤差 試劑變性、稱量

18、、稀釋不準 .隨機誤差 偶然 .過失誤差 人為的過失,系統(tǒng)誤差與隨機誤差的比較 原因 傾向 避免 評價指標 系統(tǒng)誤差 特定 有 可以 偏差 隨機誤差 偶然 無 不能 精密度 _,（二）誤 差 的 主 要 來 源,1. 試劑 標準品： 變性，批號，稱量等 標記抗原：脫落，輻射，批號等 抗體： 儲存，反復凍融等 分離劑： 配方，配制，存放等 緩沖溶液：配方，配制，變性等,2. 樣品： 采集，制備，儲存，測定 3. 操作: 待待加樣，溫度，分離等 4. 分析器具與設備: 天平，加樣器等 5. 放射性測量: 衰變 6. 數(shù)據處理 : 擬合，繪制,（二）誤 差 的 主 要 來 源,三、質量控制與指控樣品

19、,（一）質量控制的目的和內容 1.質量控制的目的 （1）近期目的：評價本次測定 （2）遠期目的：評價不同批次 2.實驗室質量控制的內容 （1）實驗室內質控 （2）實驗室間質控,放射免疫分析的系統(tǒng)誤差與隨機誤差,實驗室內質量誤差,實驗室間質量控制,批內質控,批間質控,批內精密度評 價與偏倚分析,批間精密 度與偏倚分析,對某分析 方法試劑 或試劑盒 進行綜合 評價,對不同實 驗室的分 析工作質 量進行比 較,尋找誤差產生的原因,改進分析工作質量,向主管部門提供信息,改進方法、試劑盒,促進實驗室內部質量控制,（二） 質量控制（QC）樣品,（1）對QC樣品的基本要求 1) 與待測樣品相同：人血清 2)

20、 與待測物免疫活性相同 3) 已知量：高、中、低 4) 足夠量：分裝，低溫,（2） 實驗室制備方法 收集血清 加入標準品,（3） QC樣品的使用方法,1） 確定總數(shù) n= 2） 組數(shù) N=n/3 3) 排列位置 QC首,QC尾,中間,例 如 ： 需 一 次 分析100 個 樣品 n = = 10 , N = n/3 = 10/3 = 3 = 3.33 = 3 QC首（1） ，QC中（51）， QC尾（100）,第三節(jié) 質 量 控 制 指 標,一、靈 敏 度 二、精 密 度 三、偏 差 和 準 確 度 四、特 異 性 五、穩(wěn) 定 性 六、臨 床 有 效 性,指能檢測出與零標準劑 量（即Bo管）具

21、有統(tǒng)計差別 的最小可測劑量。,第三節(jié) 質 量 控 制 指 標 一、靈敏度,靈敏度的測試方法 1.“0”劑量點的結合率的均值減去 其二倍標準差所對應的劑量值。 2. 以零劑量點的結合率降低10%的相 應劑量值作為最小可測劑量。 3. 精密度圖（P-P）圖。,第三節(jié) 質 量 控 制 指 標 一、靈敏度,靈敏度的計算方法: 1) - 2SD 2) B/Bo=90% 3) 精密度圖,第三節(jié) 質 量 控 制 指 標 一、靈敏度,（1）靈敏度 計算方法: 1) -2SD 2) B/Bo=90% 3) 精密度圖,-2SD,第三節(jié) 質 量 控 制 指 標 一、靈敏度,-2SD,二、 精 密 度,精 密 度 是

22、 指 在 一 定 條 件 下 ， 用 同 一 實 驗 方 法 檢 測 多 份 同 一 樣 品 結 果 的 重 復 程 度 （ 性 ） 。,指在一定條件下，用同一實驗方法檢測多份同一樣品結果的重復性。,標準誤差 SD = 當n=2時, SD = CV = SD/ CV%= SD/ 100%,二、 精 密 度,三、 偏倚和準確度,（一）偏倚 測定值-真值 偏移 = -100% 真值,回 收 實 驗,回 收 率 應 在 即 偏 差 允 許 在 土 之 內,三、 偏倚和準確度,三、 偏倚和準確度,（二）準確度 A =,(CV)2 + (bias)2,準 確 度 好 精 密 度 好 偏差 小,準確度 差

23、 精密度 差 偏差 大,準確度 較好 精密度 差 偏差 較小,準確度 差 精密度 好 偏差 大,三、 偏倚和準確度,（三）Youden圖,（三）Youden圖,在 待 測 樣 品 的 首 部 、 尾 部 各 放置 兩 組 樣 品 的 二 樣 本 作 圖 法 ， 稱 為 二 樣 本 圖 。,系統(tǒng)誤差和隨 機誤差都很小,系統(tǒng)誤差明顯 隨機誤差很小,兩種誤差 都很明顯,（四）健 全 性 試 驗, 標 準 品 與 待測 物 的 免 疫 學 性 質 存在明顯差異。 反 應 系 統(tǒng) 內存 在 不 可 忽 視 的 干 擾 反 應 。 劑 量 反 應 曲 線 各 反 應 管 與待 測 樣 品 管 的介 質 環(huán)

24、 境 有 較大 差 別 。,四、 特 異 性,五、穩(wěn) 定 性, Bo%、 NSB%、 QC樣品 有效劑量（ED25、ED50、ED75）,六、臨 床 有 效 性, 正常值及其波動范圍 正常值與異常值的交叉范圍 診斷符合率,75%,ED75,50%,ED50,25%,ED25,第四節(jié) 實驗室內部質量控制,一、批內誤差分析 （一）樣品復管操作誤差變異系數(shù)（OPCV）,第四節(jié) 實驗室內部質量控制,一、批內誤差分析 （二）隨機誤差的期望評價 精密度圖,. 圖的功能, 確定RIA靈敏度 lgD-SDD截距a1.4, 定劑量反應曲線 工作范圍 lgD-CVD% = 10%, 評價 I 最佳工作條件,10%

25、,第四節(jié) 實驗室內部質量控制,一、批內誤差分析 （一）樣品復管操作誤差變異系數(shù) （二）隨機誤差的期望評價 （三）批內偏倚的評價 方差分析 t檢驗,第四節(jié) 實驗室內部質量控制,一、批內誤差分析 二、批間重現(xiàn)性評價 （一）方差分析法 （二）質控圖, 無明顯異常： 2SD 但 3SD,質 控 圖, 隨 機 誤 差 較多 2SD 甚至 3SD 一定數(shù)量 3SD, 系 統(tǒng) 誤 差 一個 3SD 二個 2SD 三個 1SD, 超長 偏差 一個QC樣品超長偏差 相互接近,質控圖,第四節(jié) 實驗室內部質量控制,一、批內誤差分析 二、批間重現(xiàn)性評價 （一）方差分析法 （二）質控圖 （三）累積差和圖, s 圖, 相

26、 鄰 點 間 聯(lián) 結 的 斜 線出 現(xiàn) 連 續(xù) 上 升 或 下 降, 揭 示 有 正 偏 差 或 負 偏 差 。, 斜 線 的 斜 率 反 映偏 差的 大 小。, 3 時 ， 提示有偏差出現(xiàn)， 若 超 出 五 倍 ， 則 已 有 明 顯 的 偏 差 發(fā) 生 。,第四節(jié) 實驗室內部質量控制,一、批內誤差分析 二、批間重現(xiàn)性評價 三、實施方法及數(shù)據處理 （一）實施方法 1.靶值和控制限 2.短期：測量三次 3.長期：質控圖,第四節(jié) 實驗室內部質量控制,一、批內誤差分析 二、批間重現(xiàn)性評價 三、實施方法及數(shù)據處理 （一）實施方法 （二）數(shù)據處理,第四節(jié) 實驗室內部質量控制,（二）數(shù)據處理 1.統(tǒng)計處

27、理 2.數(shù)據保存 3.上報數(shù)據圖表 4.周期性評價 5.質量管理記錄,組 織 領 導 者 的 工 作 ： 向 各 參 評 實 驗 室 下 達 制 定 好 的 實 驗 方 案 ， 發(fā) 放 樣 品 。 統(tǒng) 一 處 理 各 實 驗 室 提 供 的 原 始 數(shù) 據 將 處 理 結 果 反 饋 給 參 評 實 驗 室 ， 并 針 對 結 果 提 出 評 價 意 見 ,參 評 實 驗 室 的 工 作 : 按 統(tǒng) 一 方 案 與 要 求 進 行 實 驗 。 定 期 向 組 織 者 提 供 實 驗 信 息（ 如 ：T、 S 、 B 、 標 準 劑 量 點 及 樣 品 等 反 應 管 放 射 性 測 量 的 原 始 數(shù) 據 ） 根 據 反 饋 的 信 息 認 真 查 找 產 生 誤 差 的 原 因 ， 并 加 以 克 服 ， 努 力 提 高 檢 測 質 量 。,外部質量評價 external quality assessment,第五節(jié) 實驗室間的外部質量評價,第六章 小結1. RIA的基本原理和特點是什么？RIA 的Scatchard方程是什么？ 2. 親和