1、第二十一章,常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application,第 一 節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization & Blotting Technology,分子雜交特性（見第二章） 探針技術(shù) 印跡技術(shù),核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 利用DNA變性與復(fù)性這一基本性質(zhì)來進(jìn)行DNA或RNA定性或定量分析的一種技術(shù)。,一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理,第 二 節(jié),聚 合 酶 鏈 反 應(yīng)Polymerase Chai

2、n Reaction（PCR）,一種可以將目的微量的DNA片斷擴(kuò)增100萬倍以上的技術(shù),(末代沙皇尼古拉二世、1918年的流行性感冒病毒、電影侏羅紀(jì)公園，以及辛普森殺妻案，這四件事情到底有什么相關(guān)？答案是沒有),PCR 可以把 指定的基因片段 數(shù)量放大百萬倍,染色體,Mullis (1993),一、基本工作原理,以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對分別與模板3和5端相互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制延模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。 重復(fù)這一過程，可使目的DNA片段得以擴(kuò)增。,（一）PCR體系基本組成成分,含Mg2+的緩沖液,dNTPs,耐熱DNA聚合酶

3、Tag DNA聚合酶,特異性引物 一對分別與待擴(kuò)增DNA序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸片段。,模板DNA,（二）PCR基本反應(yīng)步驟,變性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,循環(huán) 2530 次,使模板DNA完全變性成單鏈。同時引物自身和引物之間存在的局部雙鏈得以消除,使引物和模板DNA退火結(jié)合,此溫度下DNA聚合酶以dNTP 為底物催化DNA鏈的延長,三個步驟為一個循環(huán)， 每次循環(huán)產(chǎn)物作為下一輪模板進(jìn)入下一輪循環(huán),第一輪循環(huán),引物A,引物B,變性（95）,退火（60）,延伸（72）,DNA-Pol,DNA-Pol,溫度,第二輪循環(huán),引物A,引物B,變性（95）,退火（60）,延伸（72）,溫度,D

4、NA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,第三次循環(huán),變性（95）,退火（60）,延伸（72）,溫度,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,第一次循環(huán),第二次循環(huán),第三次循環(huán),第四次循環(huán),四、PCR的主要用途,PCR的 用途,基因突變 分析,基因的 體外突變,目的基因 的克隆,DNA 序列測定,DNA和RNA 的微量分析,1、與反轉(zhuǎn)錄結(jié)合，直接從組織細(xì)胞中的mRNA 獲得目的基因； 2、利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得目的基因片段； 3、利用簡并引物從cDNA 文庫或基

5、因組文庫中獲得具有一定序列相似性的基因片段； 4、利用隨機(jī)引物從cDNA文庫中克隆基因。,利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體外對目的DNA的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。,PCR技術(shù)高度敏感，對DNA的含量要求很低。理論上只要存在一分子的模板就可以獲得目的片段。 RNA需要反轉(zhuǎn)錄。,利用PCR結(jié)合其它技術(shù)，可以提高基因突變檢測的敏感性。,三、幾種重要的PCR衍生技術(shù),（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù) （二）原位PCR技術(shù) （三）實(shí)時PCR技術(shù),第 三 節(jié),核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis,核酸序列分析的基本原理 化學(xué)裂解法 (Maxam-Gill

6、bert法) DNA鏈的末端合成終止法 (sanger法),一、化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法),基本原理 基于某些化學(xué)試劑可以使DNA鏈在1個或2個堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強(qiáng)度，使一個斷裂點(diǎn)僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點(diǎn)斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。 分析前，用同位素標(biāo)記DNA的5末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。,二、DNA鏈末端合成終止法,又稱Sanger法，其基本原理如下： 2，3-雙脫氧核苷酸（ddNTP） 無3碳原子上的羥基，故不能與下位核苷酸形成磷酸二酯鍵。 DNA合成反應(yīng)在此終止。,2，3

7、-雙脫氧核苷酸（ddNTP）,DNA-Pol dNTPs,DNA-Pol dNTPs,DNA-Pol dNTPs,DNA-Pol dNTPs,引物,待測序模板DNA,各管分別加入四種ddNTP,ddATP,ddGTP,ddTTP,ddCTP,DNA鏈末端合成終止法基本原理,DNA鏈末端合成終止法基本流程,待測DNA模板： 3TTGCACCTGA5 引物：與模板3端互補(bǔ) DNA聚合酶（DNA-Pol） dNTP底物（其中一種用32P標(biāo)記） 四個試管中分別加入，反應(yīng)一段時間。,ddG,ddA,ddT,ddC,電 泳,三、DNA自動測序,采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。 用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸； 然后進(jìn)行Sanger測序反應(yīng)；