1、5組：李東 老師：陳思,雙酶切及連接,目錄,原理 類型 命名法 實驗 注意事項 連接 常見問題及對策,DNA的限制性酶切實驗原理,核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng)， 用于抗擊外來的侵襲。 限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 產(chǎn)生的片段端為，端為。,根據(jù)限制酶的識別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為、型三大類。,限制性內(nèi)切酶的類型,限制性內(nèi)切酶的類型,第一類（I型）限制性內(nèi)切酶：能識別專一的核苷酸順序，它們在識別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的

2、。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。,第二類（III型）限制性內(nèi)切酶：也有專一的識別順序，在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對也不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此也不能應(yīng)用于基因克隆。,限制性內(nèi)切酶的類型,第三類（型）限制性內(nèi)切酶：就是通常指的限制性內(nèi)切酶. 它們能識別雙鏈的特異順序，并在這個順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的片段； 型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識別順序一般為個堿基對的反轉(zhuǎn)重復(fù)順序； 型內(nèi)切酶切割

3、雙鏈產(chǎn)生種不同的切口端突出；端突出和平末端。 正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用， 才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質(zhì)進(jìn)行改造，從而極大地推動了分子生物學(xué)的興旺和發(fā)展。,限制性內(nèi)切酶的類型,粘性末端：是交錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。 如EcoRI的識別順序為： 5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5 在雙鏈上交錯切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5 各有一個單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶的作用而“粘合”。,II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)

4、生平頭末端。例如EcoRV 的識別位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成 5 GAT ATC 3 3 CTA TAG 5 這種末端同樣可以通過DNA連接酶連接起來。,平頭末端：,用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母表示寄主菌的物種名稱，如E. coli 用Eco表示，所以用斜體字。 用一個字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。 如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾酶，則以羅馬數(shù)字表示，如Hind, Hind，Hind等。,限制性核酸內(nèi)切酶的命名法,實驗材料及儀器,高速離心機(jī)，電爐，電泳儀

5、，制膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，量筒，移液槍，冰盒，槍頭，Ep管，手套，記號筆，TAE電泳緩沖液(10)，瓊脂糖，溴化乙錠(EB)，質(zhì)粒DNA,雙酶切,按如下體系加入到0.5ml離心管中,加體系離心 37 水浴1h 跑電泳,結(jié)果,結(jié)果與分析,質(zhì)粒的雙酶切沒有出現(xiàn)結(jié)果但marker出了條帶說明膠沒有問題，而PCR的酶切產(chǎn)物出現(xiàn)了較好的實驗結(jié)果。,內(nèi)切酶： 不應(yīng)混有其它雜蛋白特別是其它內(nèi)切酶或外切酶的污染； 注意內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)及形成的粘性末端； 內(nèi)切酶的用量：根據(jù)內(nèi)切酶單位和用量而定。 同時內(nèi)切酶體積不能超過反應(yīng)體系，因內(nèi)切酶中含甘油，體系中甘油超過會抑制內(nèi)切酶活力； 內(nèi)切酶操作應(yīng)在低溫下進(jìn)行（

6、冰上）；使用時防止操作中對內(nèi)切酶的污染。,五、注意事項限制性內(nèi)切酶酶切,連接反應(yīng),DNA 分子的體外連接（重組）是指外源 DNA 片段和載體 DNA 分子在體外通過 DNA 連接酶共價連接。 DNA酶切片段的聯(lián)接是兩DNA片段相鄰的 5磷酸和3羥基間可由聯(lián)接酶催化形成磷酸二酯鍵，即能完成聯(lián)接反應(yīng)。,連接體系,內(nèi)切酶失活 DNA不純，含有SDS，酚，EDTA等內(nèi)切酶抑制因子 條件不適（試劑、溫度） DNA酶切位點(diǎn)上的堿基被甲基化 DNA酶切位點(diǎn)上沒有甲基化（如Dpn I） DNA位點(diǎn)上存在其它修飾 DNA不存在該酶識別順序,標(biāo)準(zhǔn)底物檢測酶活性 將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA 檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最

7、佳 換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm-，dam-基因型的細(xì)菌菌株 換用不同切割非甲基化位點(diǎn)的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+ dam+菌株中擴(kuò)增 將DNA底物與DAN混勻進(jìn)行切割驗證 換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進(jìn)行驗證,六、限制性內(nèi)切酶酶切常見問題分析,問題一：DNA完全沒有被內(nèi)切酶切割,原 因,對 策,內(nèi)切酶活性下降 內(nèi)切酶稀釋不正確 DNA不純，反應(yīng)條件不佳 內(nèi)切酶識別的DNA位點(diǎn)上的堿基被甲基化或存在其它修飾 部分DNA溶液粘在管壁上 內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn) 酶切后DNA粘末端退火 由于反應(yīng)溶液、溫度、強(qiáng)烈振蕩使內(nèi)切酶變性 過度稀釋使酶活性降低 反應(yīng)條件不適 識別位點(diǎn)兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序,用5-10倍量過量消化 用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶 同上 同上 反應(yīng)前離心數(shù)秒 將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積 電泳前將樣品置65保溫5-10分鐘，取出后置冰浴驟冷 使用標(biāo)準(zhǔn)反