1、第二節(jié)基因工程的基本技術(shù),1、有毒試劑,基因工程實(shí)驗(yàn)安全,溴化乙錠（EB）：,DEPC(焦碳酸二乙酯):強(qiáng)有力的蛋白質(zhì)變性劑,丙烯酰胺：有毒，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng),過硫酸酸銨：對粘膜和上呼吸道、眼睛和皮膚有較大危害性，吸入可致命。,2、紫外線 紫外分析儀 紫外滅菌,3、放射線 放射性同位素,氯化銫：（重金屬）可因吸入、咽下或皮膚吸收而危害健康。,甲醛：毒性較大且易揮發(fā)，也是一種致癌劑,酚、氯仿：蛋白質(zhì)變性劑,4、轉(zhuǎn)基因生物,5、水電安全,需注意防止污染,1、微生物污染,2、DNA、RNA污染,3、其他污染,儀器的正確操作,微量移液器,離心機(jī),滅菌鍋,蒸餾水器,電子天平,由于提取DNA的目的、種類、

2、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等不同，DNA的提純有很多方法。,一 DNA的提取與純化,（一）、質(zhì)粒DNA的提取,plasmid DNA,The genomic DNA of E. coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell.,Genomic DNA,閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會分離，復(fù)性快；,（1）原理,1 .堿抽提法提取質(zhì)粒DNA,DNA雙鏈,變性,DNA單鏈,復(fù)性,強(qiáng)堿,中性,染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變

3、性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。,變性,（2） 所用的試劑作用, 溶菌酶,能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1，4糖苷鍵。 在堿性條件（pH8）下有活性。, 葡萄糖,增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。,EDTA,Mg2+、Ca 2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。,NaOH-SDS,NaOH：強(qiáng)堿，提供pH12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。 SDS: 溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。,冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到

4、4.8。 用來中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。,高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。,用于沉淀DNA。, 乙醇,DNA用于沉淀DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。, NaAc-HAc緩沖液, RNase A,降解RNA。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。, TE緩沖液,DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。,Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖業(yè)），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。,蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。 但苯酚會殘留在DNA溶液

5、中。 （現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。, 酚-氯仿,選用,以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。,（3）堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟,Solution I 的配制：,使用“溶液”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。,第一步：溶菌,50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶， RNase A,溶液II 破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。,第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性,Solution II 的配制：,第三步：中和,溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。,Solution III的配制：,0.2N NaO

6、H，1.0%SDS,3M 醋酸鈉（用冰醋酸調(diào)pH至4.8）,最重要的是：,2. 影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素,菌株的遺傳背景， 質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。,一般要使用endA基因發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。,（1）受體菌株,endA基因編碼核酸內(nèi)切酶，在Mg2+的存在下可將雙鏈DNA消化成7bp的寡核苷酸片斷。,這是直接決定DNA產(chǎn)量的重要因素之一。,（3）質(zhì)粒大小,分子量大的質(zhì)粒，拷貝數(shù)少。,（2）質(zhì)粒拷貝數(shù),質(zhì)粒本身的性質(zhì)所決定。,若干常用質(zhì)粒的理論產(chǎn)量,（二）、基因組或其他DNA的提取,1.細(xì)菌基因組DNA的制備,大腸桿菌基因組DNA,一般過程及原理：,（1）細(xì)

7、胞裂解,10%SDS和蛋白酶K。37 溫育。,不用NaOH !,（3）沉淀DNA,0.6倍體積的異丙醇。,（2）DNA純化,CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)除去多糖，酚-氯仿-異戊醇除去蛋白。,苯酚 2次,酚氯仿異戊醇 25 24 1 1次,氯仿異戊醇 24 1 1次,一般過程及原理：,動(dòng)物組織剪成小塊，置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)粉末。 組織培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化松散后直接使用。,（1）組織粉碎,2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA的抽提,0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 溫育。,（2）細(xì)胞裂解,（3）純化DNA,用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。,SDS是離子型去垢劑（detergent

8、），可以使細(xì)胞膜崩解。也是蛋白質(zhì)變性劑。,苯酚 2次,酚氯仿異戊醇 25 24 1 1次,氯仿異戊醇 24 1 1次,（5）除去RNA污染,用RNase。,用2倍體積的無水乙醇。,（4）沉淀DNA,（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）,一般過程及原理：,（1）組織粉碎,用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉末。,3. 從植物組織中制備 DNA,（2）細(xì)胞裂解,用2%CTAB / 2-ME (十六烷基三甲基溴化銨/2巰基乙醇）。 或1% SDS和蛋白酶K。 65 溫育。,CTAB即十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽離子去污劑，在高離子強(qiáng)度的溶液里，CTAB與蛋白質(zhì)和大多數(shù)酸性多聚糖以外的多聚糖形成復(fù)合物，只

9、是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于從大量產(chǎn)生粘多糖的有機(jī)體如植物以及某些革蘭氏陰性菌（包括E.coli的某些株）中制備純化DNA 。巰基乙醇作為還原劑使多酚氧化酶失活，可以防止酚類的氧化。,用0.6倍體積的異丙醇（-20 ）。,（3）純化DNA,用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。,（4）沉淀DNA,（5）除去RNA污染,用RNase A。,（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀） 。,（三）、DNA的定量和純度測定,1. 紫外光譜法,DNA（或 RNA）在260nm波長處有特異的紫外吸收峰。,用微量比色杯（10l）在紫外分光光度計(jì)直接測定。,原理：,蛋白質(zhì)在280nm處有吸收峰,2,

10、濃度測定步驟,一、用無菌TE或雙蒸水將待測樣品稀釋20倍或更高。,二、用無菌TE或雙蒸水做對照，將紫外分光光度計(jì)260 nm、280nm、310nm調(diào)到零點(diǎn)。,三、加入DNA稀釋液在260nm、280nm、310nm測定OD值。,四、計(jì)算DNA濃度,ssDNA：ssDNA=33（OD260OD310） 稀釋倍數(shù) dsDNA：dsDNA=50（OD260OD310） 稀釋倍數(shù) ssRNA： ssRNA=40（OD260OD310） 稀釋倍數(shù),衡量提取DNA 的純度,OD260/OD280 1.8 可能有RNA污染,OD260/OD280 1.8 可能有蛋白質(zhì)污染,再進(jìn)行酶消化處理，酚氯仿抽提去酶

11、,溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā) 紅色熒光。,2. 瓊脂糖凝膠電泳估計(jì),原理：,與已知濃度的DNA電泳帶熒光強(qiáng)度對比，就可以估計(jì)出DNA含量。,一般使用瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)混合液對比得知。,DNA分子量Marker有許多公司的商品，使用非常方便。如DNA的Hind酶切物等。,（四）、DNA分子量的估計(jì),Marker,Marker,DNA ladder,28kb,2500bp,2300bp,1300bp,900bp,750bp,200bp,5000bp,20kb,1000bp,900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300

12、bp,200bp,100bp,DNA Marker,自從瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠被引進(jìn)核酸研究以來，凝膠電泳已經(jīng)發(fā)展成為一種分析重組DNA分子的重要技術(shù)手段，同時(shí)也被廣泛地應(yīng)用于DNA 的核酸內(nèi)切酶消化片段的分析、分離和純化以及蛋白質(zhì)的分析和純化等方面的工作。,二 凝膠電泳技術(shù),1. 帶電荷的分子在電場中會以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動(dòng)，速度稱為電泳遷移率。 2. 電泳遷移率同電場的強(qiáng)度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比。 3. 電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。,（一）、電泳的基本原理,4.,如果電場強(qiáng)度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同（電泳液和凝膠）： 分子在電場中遷移

13、的速度主要取決于分子本身的大小和形狀。 形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān): 分子量越大，移動(dòng)越慢。,摩擦系數(shù)主要與分子的大小、形狀以及介質(zhì)的粘度有關(guān)。,5.,Relaxed,supercoiled,Increasing degree of supercoiling,相同分子量的DNA:,閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快， 線性分子次之， 伸展開環(huán)狀最慢。,超螺旋,線性,開環(huán),（二 ）、瓊脂糖凝膠電泳,1. 瓊脂糖,2. 瓊脂糖凝膠,瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨”。,是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。,瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（

14、密度）。,濃度高,空隙小,空隙小，分辨率高： 小分子較易通過，而大分子難通過； 空隙大，分辨率低： 大小分子幾乎以同等速率通過。,3.瓊脂糖凝膠的分辨力,空隙大小決定其分辨分子大小的能力。,帶電顆粒在電場作用下移動(dòng)的速度叫做電泳遷移率。（1）DNA分子的大小。 （2）DNA的構(gòu)象。 （3）瓊脂糖濃度。 （4）溴化乙錠使DNA遷移率下降15%。 （5）電壓。 （6）電泳緩沖液的成分及濃度。,何為電泳遷移率？影響DNA瓊脂糖凝膠電泳遷移率的因素有哪些？,優(yōu)點(diǎn)是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。,（三） 、聚丙烯酰胺凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳：分離30050000bp 聚丙烯酰胺凝膠電泳：分離11000bp

15、,（四）、凝膠染色,1. 染料,溴化乙錠。,Ethidium bromide （EB）,EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。 EB在300nm紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。 熒光強(qiáng)度與DNA含量及大小成正比。,2. 原理,UVP全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng),OMEGA8-LOGO全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng),（五）、聚丙烯酰胺凝膠銀鹽染色法,銀鹽染色法靈敏度比EB高200倍.但銀染色后，DNA不宜回收。銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色。,具體步驟,

16、1、固定液固定：2.5 ml 95%乙醇、2.5 ml冰醋酸定容到500ml,2、染色液染色：1克硝酸銀定容至500ml,3、顯色液顯色：7.5克NaOH加5.4ml甲醛定容至500ml,DNA-DNA或DNA-RNA鏈雜交。用放射性同位素（32P或125I）標(biāo)記的DNA或RNA探針。,三 核酸的分子雜交,（一）、Southern blot,用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品。,Southern blot 篩選結(jié)果,（二）、Northern blot,用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。,（三)、 原位雜交,對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。,需要目的基因的探針。,四

17、基因擴(kuò)增技術(shù)-PCR,(一)、基因擴(kuò)增（gene amplification),指生物體內(nèi)或體外人工方式使基因拷貝數(shù)大規(guī)模增加。有下列五種方式：,1. 環(huán)境誘發(fā)擴(kuò)增,2. 基因的程序性擴(kuò)增,5. PCR擴(kuò)增,3. 基因組進(jìn)化擴(kuò)增,4. 基因工程擴(kuò)增,1. 環(huán)境誘發(fā)擴(kuò)增,如氨甲喋呤誘發(fā)二氫葉酸還原酶基因擴(kuò)增。,在環(huán)境因子的誘發(fā)下，某些基因產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增。,在發(fā)育的某個(gè)階段，某些基因的大量擴(kuò)增。,2. 基因的程序性擴(kuò)增,如非洲爪蟾卵子形成過程中rRNA基因的擴(kuò)增。,生物進(jìn)化過程中基因組中某些基因的拷貝數(shù)增加，結(jié)果相關(guān)的基因聚集成簇。,5. PCR擴(kuò)增,應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Ch

18、ain Reaction，PCR）技術(shù)，在體外特異性地?cái)U(kuò)增某個(gè)基因。,3. 基因組進(jìn)化擴(kuò)增,4. 基因工程擴(kuò)增,載體攜帶目的基因在寄主細(xì)胞中大量復(fù)制。,（1）,1. PCR的發(fā)明,(二)、PCR技術(shù),1971年Khorana提出體外人工復(fù)制DNA的設(shè)想。,當(dāng)時(shí)由于引物和DNA聚合酶及DNA測序技術(shù)都沒有解決，設(shè)想未能實(shí)現(xiàn)。,Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)是利用酶促反應(yīng)在體外指導(dǎo)特定DNA序列擴(kuò)增的方法，以熱變性的雙鏈DNA分子為模板，利用引物和四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）為原料在DNA聚合酶的作用下大量擴(kuò)增了特定的DNA片段。,（2）,Mullis由此獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,1985年Cetus公司的科學(xué)家K.B. Mullis發(fā)明了PCR，使這一設(shè)想變成現(xiàn)實(shí)。,（3）Taq DNA 聚合酶,1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反應(yīng)中。使 PCR自動(dòng)循環(huán)儀成為可能。,（4）PCR 儀,1988年 Cetus公司發(fā)明自