1、酶解發(fā)酵工藝對配合飼料粗蛋白質(zhì)和干物質(zhì)消化率的影響楊雪海1，2李紹章 趙娜 魏金濤 嚴(yán)念東 張巍 郭萬正 黃少文 1湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064 2動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064摘要：本試驗通過體外消化法，研究了不同工藝酶解發(fā)酵部分原料對配合飼料粗蛋白質(zhì)和干物質(zhì)消化率的影響。試驗結(jié)果表明：酶解發(fā)酵同時進(jìn)行的生產(chǎn)工藝配合飼料粗蛋白質(zhì)消化率較空白對照組、單酶解組和單發(fā)酵組分別提高了11.19%、7.43%、7.48%，差異顯著（p0.05），干物質(zhì)消化率有提高的趨勢，但差異不明顯（p0.05）。 酶解和發(fā)酵等新型生物技術(shù)在飼料產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用是未來飼料

2、行業(yè)發(fā)展的必然趨勢。植物蛋白飼料原料經(jīng)酶解發(fā)酵后可明顯降低抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量、增加小肽和游離氨基酸的含量（張健等，2012；王剛等2011）。經(jīng)酶解發(fā)酵處理的植物蛋白具有易吸收、低抗原等特點，被認(rèn)為是動物飼料的理想蛋白來源(李紹章等，2004；范彥令等，2006；feng等，2007)。這對于提高動物飼料植物蛋白利用率、緩解原料不足具有重要的意義。 體內(nèi)消化率能夠比較準(zhǔn)確地對飼料營養(yǎng)價值進(jìn)行評價，但耗時、費力，很難在短時間內(nèi)對飼料樣品進(jìn)行評價。而體外消化是模擬試驗動物的消化生理條件，以動物消化道內(nèi)酶液或人工酶液為消化酶，利用酶促反應(yīng)的原理，在試管、三角瓶等容器內(nèi)對飼料物質(zhì)進(jìn)行離體消化水解作用，具

3、有簡單、快捷、重復(fù)性好等特點，在飼料營養(yǎng)價值評定方面占有重要位置(bassompierre等，1997；chong等2002；張鐵鷹等，2005)。目前，大多數(shù)試驗研究局限于原料酶解發(fā)酵后消化率的測定，但對酶解發(fā)酵工藝及酶解發(fā)酵部分原料后對配合飼料消化率的影響卻鮮見報道。本試驗通過體外消化法研究不同工藝條件下酶解發(fā)酵部分原料對配合飼料粗蛋白質(zhì)和干物質(zhì)消化率的影響，為飼料的酶解發(fā)酵工藝及酶解發(fā)酵飼料在實際應(yīng)用中的效果奠定理論基礎(chǔ)。1、材料1.1液態(tài)基料 玉米和豆粕按質(zhì)量比1:3混合均勻粉碎過1.5mm篩片。1.2固態(tài)配合飼料 全價配合飼料中除掉液態(tài)基料后的剩余植物蛋白原料，具體配方組成見表1。表

4、1 固態(tài)配合飼料配比名稱含量（%）玉米76.14豆粕10.15麩皮6.34膨化大豆6.341.3酶解發(fā)酵劑 菠蘿蛋白酶購置于廣西生物技術(shù)有限公司，酶活120萬iu/g，批號20120524；酵母購置于湖北安琪酵母股份有限公司，活菌含量200108cfu/g,批號20120428。1.4生化試劑 胃蛋白酶（1：3000）及胰蛋白酶(1:250)購置于sigma公司，濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙醇等化學(xué)試劑均購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司。1.5主要實驗儀器 恒溫培養(yǎng)箱、全自動凱氏定氮儀foss 2300、干燥箱、上海理達(dá)psh-25c酸度計、抽氣機(jī)。2、方法2.1試驗設(shè)計與處

5、理試驗設(shè)計與處理見表2。 表2 實驗設(shè)計與處理編號處理方式a空白對照b單獨酶解（菠蘿蛋白酶）c單獨發(fā)酵（酵母）d酶解+發(fā)酵（同時添加菠蘿蛋白酶和酵母）e先發(fā)酵最后4小時酶解（酵母發(fā)酵20h后酶解4h）f先酶解（作用4小時后滅活）+發(fā)酵（酶解4h后滅活酵母發(fā)酵20h）2.1 液態(tài)酶解發(fā)酵飼料的制作分別稱取20g液態(tài)基料于250ml的燒杯中，按實驗處理每克液態(tài)基料分別添加107cfu酵母，菠蘿蛋白酶按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%添加，加入70ml的實驗室用水，置37恒溫培養(yǎng)箱中，酶解發(fā)酵24h。2.2 配合飼料的制作酶解發(fā)酵液態(tài)基料24h后，置于80的烘箱中滅活10-15min，加入80g固態(tài)配合飼料，充分?jǐn)嚢杈?/p>

6、勻，于65烘箱中烘干備用。2.3體外消化的測定2.3.1樣品處理 粉碎上述備用飼料樣品，過50目篩，裝入廣口瓶中密封，低溫保存。2.3.2胃消化階段準(zhǔn)確稱取1g飼料樣品（精確至0.0001g），置于100ml具塞三角瓶中，向瓶中加入15ml磷酸緩沖液（0.2m，ph6.0），小心混合均勻后，加入10ml 0.2 m hcl溶液，將食糜ph值調(diào)整至2.0（用1m的hcl或1m的naoh），然后加入1ml新鮮的20 mg/ml胃蛋白酶鹽酸溶液(1500 u/ml, 0.18 mol/l hcl)or (內(nèi)含3 000u/ng+0.18 mol/l hcl),，并使ph仍保持在所設(shè)ph值。加入0.5

7、ml細(xì)菌生長抑制劑（0.5%氯霉素乙醇溶液），用橡膠塞封口。于40恒溫水浴搖床中（120次/min），放入5min后開始計時，消化時間為4 h/6h。2.3.3小腸消化階段待胃消化階段結(jié)束后，向食糜中加入10ml磷酸緩沖液（0.2m，ph 6.8），和5ml 0.6m的naoh溶液，調(diào)整食糜ph至6.5（用1m的hcl或1m的naoh），然后加入1ml 50 mg/ml豬胰酶( sigma p-1790)溶液,并使ph值仍保持在所設(shè)ph值。用橡膠塞封口后，于40恒溫水浴搖床中（120次/min），放入5min后開始計時，消化時間為18h。2.3.4小腸消化期結(jié)束消化殘渣收集及指標(biāo)檢測 在消化殘

8、渣中加入5ml 20三磺基水楊酸，室溫下放置30min，將三角瓶中的殘留物用1磺基水楊酸溶液完全沖洗到漏斗中，真空抽濾，最終將殘渣連同已知重量的無氮濾紙置于105烘箱中烘干至恒重，稱重，并測定殘渣蛋白。2.4蛋白質(zhì)的測定蛋白質(zhì)的測定參照gb/t 6432飼料中粗蛋白質(zhì)測定方法進(jìn)行。2.4干物質(zhì)消化率的測定 干物質(zhì)消化率的測定參照等（1992）的方法進(jìn)行。2.5 ph的測定 將酶解發(fā)酵的液態(tài)基料攪拌均勻，稱取5.0g于45ml的蒸餾水中，用三層紗布過濾后用酸度計直接檢測濾液的ph值。2.6 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用sas6.12的t-test 進(jìn)行兩組均數(shù)的差異顯著性檢驗。3、結(jié)果與分析3.1 酶解發(fā)酵

9、對液態(tài)基料的ph值的影響 不同酶解發(fā)酵工藝對液態(tài)基料ph值的影響見表3。不同酶解發(fā)酵工藝的ph值24h后有明顯降低的趨勢，但各處理間差異不顯著（p0.05）。表3不同酶解發(fā)酵工藝過程中ph變化情況不同處理方式時間abcdef0h6.300.02a6.260.01a6.300.03a6.260.02a6.300.01a6.260.04a24h4.280.05a4.270.03a4.460.06a4.620.02a4.510.01a4.450.03a注：同行肩標(biāo)不同者表示差異顯著（p0.05）3.2不同酶解發(fā)酵工藝對配合飼料粗蛋白質(zhì)消化率的影響 不同酶解發(fā)酵工藝對配合飼料粗蛋白質(zhì)消化率的影響見表4

10、。由表中數(shù)據(jù)可知，酶解發(fā)酵同時進(jìn)行的生產(chǎn)工藝粗蛋白質(zhì)消化率較空白對照組、單酶解組和單發(fā)酵組分別提高了11.19%、7.43%、7.48%，差異顯著（p0.05），表4 不同酶解發(fā)酵工藝對配合飼料粗蛋白質(zhì)消化率的影響處理方式配合飼料粗蛋白消化率（%）a70.130.02ab72.590.38ac72.550.52ad77.980.49be75.060.64bf77.330.57b注：同列肩標(biāo)不同者表示差異顯著（p0.05）3.3不同酶解發(fā)酵工藝對配合飼料粗干物質(zhì)消化率的影響不同酶解發(fā)酵工藝對配合飼料粗干物質(zhì)消化率的影響見表5。各處理組間干物質(zhì)消化率差異不顯著（p0.05）。表5 不同酶解發(fā)酵工藝

11、對配合飼料粗干物質(zhì)消化率的影響處理方式配合飼料干物質(zhì)消化率（%）a29.750.87ab29.620.46ac29.390.35ad32.351.67ae31.330.62af31.270.58a注：同列肩標(biāo)不同者表示差異顯著（p0.05）4、討論4.1酶解發(fā)酵對日糧酸化的影響 幼齡動物，由于自身消化系統(tǒng)發(fā)育不完善，胃酸和消化酶分泌不足，常使胃腸道 ph高于酶活性和有益菌群生長的適宜范圍，必須依賴外源性飼料來幫助改善消化道中的酸堿環(huán)境，因此，對胃酸分泌不足的幼齡動物有較好的使用效果 （朱碧泉等，2008；石寶明等，1999）。此外，日糧酸化還能有效抑制大腸桿菌、沙門氏菌等幾種有害的腸道細(xì)菌的生

12、長和繁殖，減少動物腸道疾病的發(fā)生（李軍等，2011）。本次試驗研究中，飼料原料經(jīng)液態(tài)酶解發(fā)酵后基料的ph值達(dá)到4.6左右，這可能與酶解發(fā)酵產(chǎn)生的小肽、游離氨基酸和大量豐富的有機(jī)酸有關(guān)。較低ph值的液態(tài)基料與固態(tài)配合飼料混合也可能是酸化配合日糧、減少配合飼料雜菌的另一技術(shù)途徑之一。4.2酶解發(fā)酵有利于蛋白質(zhì)消化率的提高植物蛋白經(jīng)酶解發(fā)酵后，大分子蛋白質(zhì)被分解成小分子蛋白質(zhì)、寡肽、小肽和游離氨基酸（李紹章等，2004；馬文強(qiáng)等，2008；柯祥軍等，2008），易被幼齡動物胃腸道完整吸收，有利于提高機(jī)體對飼料養(yǎng)分的消化利用率 。章世元等（2008）報道日糧添加 17.5%和 35%發(fā)酵豆粕提高了斷奶

13、仔豬蛋白質(zhì)消化率。劉寧等（2009）報道酶解豆粕顯著提高了肉仔雞對干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、能量、鈣和磷的消化率，表明酶解豆粕較普通豆粕更有利于肉雞對養(yǎng)分的消化利用。 本試驗在液態(tài)情況下，采用酶解發(fā)酵同時進(jìn)行的生產(chǎn)工藝，配合飼料粗蛋白質(zhì)體外消化率較空白對照組提高了11.19%，體外消化試驗進(jìn)一步證實了飼料原料酶解發(fā)酵后有利于該原料消化利用率的提高。4.3酶解發(fā)酵對干物質(zhì)消化率的影響 飼料營養(yǎng)物質(zhì)消化率是影響動物生長的重要因素。經(jīng)酶解發(fā)酵后，不同工藝條件下配合飼料干物質(zhì)消化率與對照組有提高的趨勢，但差異不顯著（p0.05）。這和劉寧等（2009）報道的酶解豆粕在生產(chǎn)中提高了肉雞配合飼料的干物質(zhì)消化率不一

14、致，這可能是體內(nèi)消化和體外消化的差異造成的。5、結(jié)論 試驗研究表明酶解和發(fā)酵同時進(jìn)行的生產(chǎn)工藝，能顯著提高配合飼料粗蛋白質(zhì)的消化率（p0.05），有提高干物質(zhì)消化率的趨勢（p0.05），這對酶解發(fā)酵飼料在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要的理論意義。參考文獻(xiàn)1馬文強(qiáng),馮杰,劉欣微生物發(fā)酵豆粕營養(yǎng)特性研究j中國糧油學(xué)報，2008,23（1）：121-124.2李紹章，梁運(yùn)祥大豆發(fā)酵降解的多肽在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用j.飼料廣角，2004,7:36393 feng j，liu x，liu y y，et a1effects of aspergillus oryzae 3.042 fermented soybean

15、meal on growth performance and plasma biochemical pararneters in broilersjanim feed sci technol，2oo7，134：2352424劉寧,張權(quán)益,等. 酶解豆粕對肉雞生產(chǎn)性能和養(yǎng)分消化率的影響j.中國畜牧獸醫(yī),2009,36(11):9-11.5,等.豬離體消化試驗的不同處理方法對飼料干物質(zhì)和蛋白質(zhì)消化率的影響j.6石寶明,單安山飼用酸化劑的作用與應(yīng)用j飼料工業(yè)，1999，1：137朱碧泉,曾秋風(fēng)，丁雪梅，等.復(fù)合有機(jī)酸和黃霉素對肉雞生產(chǎn)性能及腸道微生態(tài)的影響j中國家禽,2008,30(6)：1417.8李軍,盧玉飛,等.復(fù)合酸化劑的日糧酸化作用及對營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響j.中國飼料,2011,14:23-28.9張鐵鷹，汪儆.單胃動物體外消化模擬技術(shù)研究進(jìn)展j.動物營養(yǎng)學(xué)報,2005,17(2):1-8.10bassompierre m,borresen t,sandfeld p,et al. an evaluation of open a closed systems for in vitro protein digestion of fishmealj.aqua.