1、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟 簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)步驟如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小時(shí).2.-20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘3.PBS洗凈:3min34.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗凈:25min6.羊血清封閉：度，分鐘.一抗，度過(guò)夜，一般要大于小時(shí)或者度小時(shí).度PBS洗凈，min次.二抗度小于一小時(shí).度PBS洗凈，min涼干封片（封閉液.） 活細(xì)胞免疫熒光技術(shù)流式細(xì)胞儀標(biāo)本的制備（一）制備活性高的細(xì)胞懸液(培養(yǎng)細(xì)胞系、外周血單個(gè)核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞等均可用于本法)用10FCSRP

2、MI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為51010ml取40l細(xì)胞懸液加入預(yù)先有特異性McAb(550l)的小玻璃管或塑料離心管，再加50l 120(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清4 30min用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右1000rpm5min棄上清，加入50l工作濃度的羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標(biāo)記物，充分振搖4 30min用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右1000rpm5min加適量固定液(如為FCM制備標(biāo)本，一般加入1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細(xì)胞濃度加入100500l固定液)FCM檢測(cè)或制片后熒光顯微鏡下觀察(標(biāo)本在試管中可保存57天)（二）試劑和器材1.各種特異性單克隆抗

3、體。2.熒光標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。3.10 FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液(見(jiàn)附錄)。4.玻璃管、塑料管、離心機(jī)、熒光顯微鏡等。（三）注意事項(xiàng)1.整個(gè)操作在4下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN，上述實(shí)驗(yàn)條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。2.洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。3.加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。4.細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。附:1. DPBS (10, 貯存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸餾水加至1000ml

4、NaHPO 11.5g 臨用時(shí)用蒸餾水110稀釋KHPO 2g2.洗滌液DPBS900mlFCS 50ml (終濃度5)4NaN?50ml (終濃度0.2)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (終濃度2)甲醛10mlNaN0.2g (終濃度0.02)4.玻璃管、塑料管、離心機(jī)、熒光顯微鏡等。（三）注意事項(xiàng)1.整個(gè)操作在4下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN，上述實(shí)驗(yàn)條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。2.洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。3.加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。4.細(xì)胞活

5、性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。附:1. DPBS (10, 貯存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸餾水加至1000mlNaHPO 11.5g 臨用時(shí)用蒸餾水110稀釋KHPO 2g2.洗滌液DPBS900mlFCS 50ml (終濃度5)4NaN?50ml (終濃度0.2)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (終濃度2)甲醛10mlNaN0.2g (終濃度0.02) 嚴(yán)重同意樓上的講解。我是做流式細(xì)胞分析的間接熒光，圖簡(jiǎn)單加一抗后只洗滌一次，二抗后沒(méi)有洗滌，就直接加另外一個(gè)抗體，結(jié)果做了好多次就是呈陰性反應(yīng)！排除了好久才多洗滌了兩次，結(jié)果很是令人滿意。我想請(qǐng)問(wèn)樓上：NaN哪里有

6、賣(mài)？謝謝！我找過(guò)，發(fā)現(xiàn)它是一種化學(xué)工業(yè)產(chǎn)品，成桶成桶的賣(mài)，而且有劇毒?。∈遣皇遣皇峭环N東東？ 我做的是zo-1的免疫熒光，步驟如下：1、細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)融合到95100時(shí)，從孵箱中取出。2、用預(yù)溫的1PBS洗3次，每次10分鐘3、4的甲醛室溫固定2030分鐘4、1PBS洗3次，每次10分鐘5、0.2Triton X100透化25分鐘6、1PBS洗3次，每次10分鐘7、5%BSA室溫封閉30分鐘8、加一抗（用1BSA稀釋?zhuān)┓旁跐窈欣铮?度過(guò)夜9、1PBS洗3次，每次10分鐘10、加二抗（用1BSA稀釋?zhuān)?0分鐘，閉光！11、1PBS洗3次，每次10分鐘12、95甘油封片注：4%甲醛，0.2%T

7、riton，5%BSA均用1PBS稀釋 從大鼠分離的T細(xì)胞能否直接做細(xì)胞免疫熒光 我做的大部分細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1.取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時(shí)候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來(lái)回夾取，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來(lái)。洗的時(shí)候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒(méi)有等5分鐘或10分鐘。2. 4冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。3. 0.2Triton X100通透10分鐘，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。5. 一抗4度濕

8、盒內(nèi)過(guò)夜，也可37度2小時(shí)，感覺(jué)前者效果好，PBS洗三遍。6.二抗室溫2小時(shí)（避光），或者37度1半小時(shí)，PBS洗三遍。7.最好用DAPI染核，然后直接照熒光片。8.蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因?yàn)楦视筒幌髽?shù)脂那樣會(huì)干，所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。建議：1.還是染完之后沒(méi)有封片前直接照一些，因?yàn)橛械臅r(shí)候可能封片會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，再想照反而沒(méi)有了，另外不要拖太長(zhǎng)時(shí)間，熒光會(huì)崔滅的。2.熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話，過(guò)一段時(shí)間仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定離心，不然有的時(shí)候有那種沉淀，在片子上就是一個(gè)很大的非特異性熒光光點(diǎn)，非常難看。 我要做的是occlu

9、din，可是效果不是很好，可以用甲醇固定嗎，和甲醛比那個(gè)合適 各位同仁:我現(xiàn)在急于做人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的免疫熒光實(shí)驗(yàn)，目的是測(cè)凋亡時(shí)，基因bax、bcl-2的蛋白表達(dá)變化。不知道怎么選一抗和二抗試劑盒。請(qǐng)高手指教。萬(wàn)分感謝！能發(fā)一個(gè)郵件更好，再一次感謝！我的E-mail： 抗淬滅劑可拿來(lái)直接封片,20微升即可.之后片子可保留更長(zhǎng)時(shí)間 bu不是原創(chuàng) 我是做懸浮細(xì)胞THP-1的，是人單核細(xì)胞系，主要問(wèn)題是懸浮細(xì)胞在洗滌以及孵育次數(shù)多了會(huì)越洗越少，請(qǐng)問(wèn)各位怎么洗法細(xì)胞不會(huì)變少。（離心轉(zhuǎn)速比較重要，還有有人說(shuō)離心后上清不用移液器吸，直接倒比較好，我也試過(guò)，可還是越來(lái)越少） 頂一下 我也遇到了