1、2.6.1 一個氨基酸的-COOH與另一個氨基酸的-NH2縮合脫去一分子水形成的酰胺鍵叫作肽鍵；氨基酸以肽鍵結(jié)合形成的化合物稱作肽。,2.6 氨基酸彼此以肽鍵結(jié)合形成鏈狀多肽,肽鍵,二肽,這種縮合作用可反復(fù)進(jìn)行，形成二肽、三肽、寡肽及多肽； 肽鏈中一個氨基酸單位稱為一個氨基酸殘基(residue)，一個氨基酸殘基較游離氨基酸少一個水分子（末端除外）,平均分子量110； 肽鏈的大小可用所含氨基酸殘基的總數(shù)表示或相對分子質(zhì)量表示，大多數(shù)天然多肽含50200個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量在5,500220,00之間；,2.6.2 肽鏈?zhǔn)怯蟹较蛐缘?directional),肽鏈的一端有游離氨基，稱氨基末

2、端（或N末端 N-terminal），另一端有游離羧基，稱羧基末端（或C末端 C-terminal)； 肽鏈寫法：游離-氨基在左，游離-羧基在右，氨基酸之間用“”表示肽鍵。,如：H2N絲氨酰亮氨酰苯丙氨酸-COOH 寫為：,Ser-Leu-Phe,（或 S-L-F）,前述五肽：絲氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸,寫為：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu,（或 S-G-Y-A-L）,H2N-,-COOH,肽鍵,縮合,2.6.3 所有肽鏈的共價主鏈結(jié)構(gòu)都是相同的,肽鏈中的骨架結(jié)構(gòu)是由 單位重復(fù)連接而成，稱共價主鏈（main chain or backbone)；,不同肽鏈的區(qū)別在于側(cè)鏈R基

3、的排列順序不同；,相同的氨基酸組成可形成多種不同的多肽鏈,問題1：每種肽鏈都有相同的分子骨架，試分析多肽分子骨架有哪些結(jié)構(gòu)特征？,問題2：寫出這一肽鏈的結(jié)構(gòu) 和名稱,這四種氨基酸還可以 組成幾種寡肽？,2.6.4 肽鏈末端羧基、末端氨基及側(cè)鏈基團(tuán)可發(fā)生不同程度的解離，表現(xiàn)出重要的理化性質(zhì),在pH114范圍內(nèi)，主鏈上肽鍵氨基不發(fā)生解離，游離末端的-COOH和-NH2以及側(cè)鏈R上的基團(tuán)可發(fā)生不同程度的解離； 各基團(tuán)解離程度及肽所帶的總電荷取決于所處溶液的pH值； 對于指定的基團(tuán)，其pHpKa時，不發(fā)生酸式解離，pHpKa時，發(fā)生酸式解離，pH= pKa時，解離與不解離各占一半，由此可確定肽鏈所帶凈

4、電荷.,問題3：肽鏈中可解離基團(tuán)的（-COOH，-NH2 及側(cè)鏈可解離基團(tuán)）pKa與游離氨基酸中對應(yīng)基團(tuán)的pKa值有何不同？為什么？,問題4 ：叢肽鏈的組成與結(jié)構(gòu)分析多肽有哪些主要性質(zhì)？,肽具有等電點，調(diào)節(jié)溶液pH值可改變肽的帶電狀況，使肽不帶電荷而處于等電狀態(tài)時的pH值為肽的等電點 肽等電點的差別可不同程度反映其氨基酸組成上的差異；反之亦然。 等電狀態(tài)時，肽在電場中不向任何一方移動 不同大小的肽片斷可用雙向凝膠電泳進(jìn)行分離 肽鏈中的解離基團(tuán)可被滴定，但 肽的滴定曲線復(fù)雜 短肽以離子晶體存在，具有較高的熔點 肽鍵上的基團(tuán)具有相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)活性。,2.6.5 許多短肽具有重要的生物活性 天然存在

5、的活性肽,作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)激素或神經(jīng)調(diào)節(jié)物；如LHRH-類10肽(蛙的一種神經(jīng)遞質(zhì))，促甲狀腺素釋放因子，腦啡肽，內(nèi)啡肽，強(qiáng)啡肽等 作為抗體：短桿菌肽A，短桿菌肽S等； 作為激素：胰島素、胰高血糖素、促腎上腺皮質(zhì)激素等； 作為防御性毒物：劇毒的鵝膏蕈堿、蛇毒、蛛毒等,體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽,促甲狀腺素釋放激素TRF,焦谷氨酸 組氨酸 脯氨酰胺,谷胱甘肽（glutathione ，GSH）,L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰甲酯，稱作：aspartame,2.7.1 多肽與蛋白質(zhì)的概念不完全相同 The term protein broadly defines molecules composed

6、of one or more polypeptide chains; The term polypeptide is used to define the chain exceeds several dozen amino acids in length (less than 50 amino acid residues); The terms polypeptide and protein are used interchangeably in discussing single polypeptide chain. 問題5：試簡述蛋白質(zhì)的重要生物學(xué)功能？,2.7 蛋白質(zhì)是由一條或幾條多肽鏈

7、組成的具有特定空間結(jié)構(gòu)和功能的生物大分子,2.7.2 根據(jù)蛋白質(zhì)的組成、或含多肽鏈數(shù)目或形狀可對蛋白質(zhì)進(jìn)行不同的分類,單純蛋白質(zhì)(simple protein),輔基種類很廣，常見的有色素化合物、寡糖、脂類、磷酸、金屬離子甚至核酸,根據(jù)組成不同蛋白質(zhì)可分為,根據(jù)蛋白質(zhì)形狀可分為球狀蛋白與纖維狀蛋白：,肌動蛋白,毛發(fā)中的角蛋白,蠶絲絲心蛋白,根據(jù)含多肽鏈數(shù)目可分為單體蛋白和多體蛋白,寡聚蛋白中的每一個具三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱亞基(subunit),應(yīng)用：由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去;,2.8.1 多數(shù)球狀蛋白質(zhì)溶于水形成膠體溶液,蛋白質(zhì)溶膠性質(zhì)：

8、a.質(zhì)點大小在膠體范圍：1100nm b.丁達(dá)爾效應(yīng) c.布朗運動 d.不能透過半透膜,2.8 根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)特點可對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離鑒定,蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。,破壞蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定因素，將促使蛋白質(zhì)沉淀析出,蛋白質(zhì)處于PI時，凈電荷為零。溶解度最低 不同蛋白質(zhì) 等電點不同 調(diào)節(jié)pH值 將蛋白質(zhì)彼此分開,2.8.2等電點沉淀和pH控制:,隨著鹽濃度的升高，如飽和或半飽和時，蛋白質(zhì)溶解度逐漸降低，相互聚集而從水溶液中沉淀析出，這種現(xiàn)象叫鹽析。 解釋：大量中性鹽的加入，使水的活度降低，原來的溶液中的大部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。降低蛋白質(zhì)極性

9、基團(tuán)與水分子間的相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。 常用的中性鹽：（NH4)2SO4 特點：保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象蛋白質(zhì)分離、提純常用方法。,2.8.3 加入大量中性鹽可使蛋白質(zhì)沉淀析出 低濃度時，中性鹽可增加蛋白質(zhì)的溶解度，即鹽溶 原因：蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，且與水分子相互作用加強(qiáng)；,2.8.4 有機(jī)溶劑分級分離法：,作用原理：有機(jī)溶劑的加入改變了介質(zhì)的介電常數(shù)，增加了兩個相反電荷之間的吸引力，蛋白質(zhì)的表面可離解基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，蛋白質(zhì)分子聚集沉淀。 有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集體形成并沉淀。,2.8.5 離子交換層析,原理：

10、樣品中各蛋白質(zhì)組分的凈電荷、分子大小不同，與固定相間的作用力不同而被分離 洗脫方法：改變洗脫劑的鹽濃度、PH值依次洗脫 結(jié)合力小的蛋白質(zhì)先由層析柱中洗脫出來 分離效果與溶液中的離子強(qiáng)度、pH有關(guān) 常用固定相： 離子化纖維素羧甲基纖維素（CM），二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素優(yōu)點：具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，及較大的表面積，大分子可以自由通過交換容量大,洗脫條件溫和,回收率高。 離子化葡聚糖交聯(lián)葡聚糖作基質(zhì) 優(yōu)點：交換容量比離子交換纖維素大34倍。,Cation- exchange column,pH=5.0時，基質(zhì)帶負(fù)電荷 蛋白組分帶不同電荷,逐漸提高洗脫液的pH值，各組分以此被洗脫下來 問：

11、洗脫順序？,即分子排阻層析（也稱凝膠過濾層析，分子篩層析）,2.8.6 凝膠過濾：,原理：凝膠顆粒內(nèi)部為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)不同分子大小的蛋白質(zhì)混合物流經(jīng)凝膠層析柱時，比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外。隨著溶劑在凝膠珠之間的孔隙向下移動并最先流出柱外；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠珠的內(nèi)外。不同分子大小路徑不同洗脫： 大分子-先洗脫出來 小分子-后洗脫出來,2.8.7 親和層析,基礎(chǔ)：基于蛋白質(zhì)所具有的生物學(xué)特異性。（它與另一種稱配基的分子能特異而非共價的結(jié)合）,蛋白質(zhì)樣品加入到連有配基的基質(zhì)中（固定相） 目標(biāo)蛋白質(zhì)與配體結(jié)合，吸附在瓊質(zhì)糖顆粒上 其它蛋白質(zhì)先

12、被洗脫下來 結(jié)合在基質(zhì)上的蛋白 可用由配體溶液洗脫,Affinity chromatography,對某一種蛋白質(zhì)來說，在某一pH時，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，即凈電荷為零，這一pH稱蛋白質(zhì)的等電點。 pHpI時，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷，電場中移向正極 pHpI時，蛋白質(zhì)帶凈正電荷，電場中移向負(fù)極 pH=pI時，蛋白質(zhì)不帶靜電荷，電場中不移動。,2.8.8 利用蛋白質(zhì)的帶電性可對蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離,非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白質(zhì)在(PAGE)介質(zhì)中電泳時，其遷移率,聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS和少量巰基乙醇,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法：,則電泳遷移率主要取決于其相對分子質(zhì)量(q/r），而與

13、電荷和分子形狀無關(guān)。,SDS為陰離子，多肽鏈覆蓋上相同密度的負(fù)電荷超過蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。因此，所有SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳時均以同樣的電荷/分子質(zhì)量比向正極移動。 改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象。SDS-蛋白質(zhì)在水溶液中長橢圓棒，短軸直徑均為1.8nm,長軸長度則隨蛋白質(zhì)的分子量而成正比例地變化。 可用來測量蛋白質(zhì)的分子量,區(qū)帶電泳：外加電場時，蛋白質(zhì)混合物在具有pH梯度的介質(zhì)中移向并聚焦（停留）在等于其等電點的pH處，形成區(qū)帶。,測定蛋白質(zhì)含量的常用方法： 凱氏定氮法： 紫外吸收法 雙縮脲法： Folin-酚試劑法（Lowry法）： 考馬斯亮藍(lán)法（現(xiàn)

14、最常用的方法）： 膠體金法：帶負(fù)電的疏水膠體，洋紅色，遇蛋白質(zhì)變藍(lán)色，靈敏度最高,蛋白質(zhì)具有多個結(jié)構(gòu)層次： 一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu) 生物功能 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸的排列順序也稱共價結(jié)構(gòu)。 共價肽鍵是一級結(jié)構(gòu)的唯一連接方式 多肽鏈一級結(jié)構(gòu)決定著蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)和功能,2.9 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定即蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸序列的測定,高級結(jié)構(gòu),測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目； 拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈； 測定多肽鏈的氨基酸組成； 分析多肽鏈的N末端和C末端（方法很多） 斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵； 多肽鏈斷裂成肽段； 測定各個多肽段的氨基酸順序； 確定肽段在多肽鏈中的次序； 確定原多

15、肽鏈中二硫鍵的位置。,蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定策略,測得相對分子質(zhì)量Mr 很多方法可用于確定蛋白質(zhì)的相對分子量，如：滲透壓、擴(kuò)散系數(shù)、沉降系數(shù)凝膠過濾、凝膠電泳等， 測定末端氨基酸數(shù)x X (m /Mr ) = n (蛋白質(zhì)分子中肽鏈數(shù)目)（m為樣品質(zhì)量）,變性：8mol/L尿素或6mol/LHCI，或高濃度鹽溶液 如有二硫鍵交聯(lián)：巰基乙醇，或過氧乙酸處理 凝膠過濾或電泳分離不同肽鏈,蛋白質(zhì)中多肽鏈的拆分,蛋白質(zhì)中多肽鏈數(shù)目的確定,多肽鏈的拆分,氨基酸組成分析,酸水解： 堿水解： 甲基磺酸水解： 優(yōu)點： 不破壞色氨酸， 經(jīng)堿中和后可直接上機(jī)自動分析 缺點：不能有碳水化合物存在 中和點不易掌握 計算出

16、各種氨基酸分子比 多肽鏈分子量,確定氨基酸組成,末端氨基酸分析,N末端氨基酸分析 丹黃酰氯法(DNS)： 優(yōu)點：可直接層析或電泳分離，熒光檢測定性定量；靈敏度高(較二硝基氟苯 法高100倍) 二硝基氟苯 (DNFB or FDNB)法 氨肽酶法,+ HCI,弱堿性,+ DNS-氨基酸,酸水解,游離氨基酸,有機(jī)溶劑萃取,溶于水,定量 + 定性,確定N末端氨基酸,確定肽鏈數(shù)目,DNS-氨基酸,將肽鏈裂解成小片斷,要求：斷裂點較少，專一性較強(qiáng)、產(chǎn)率高 酶裂解法：常用的酶： 胰蛋白酶：僅斷裂Lys、Arg羧基形成的肽鍵（但） 糜蛋白酶：位點：Tyr、Phe、Trp羧基肽鍵 胃蛋白酶：位點：兩種疏水性氨

17、基酸形成的肽鍵 嗜熱菌蛋白酶：專一性較差 金黃色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）： 梭狀芽孢桿菌蛋白酶（Arg蛋白酶）： 化學(xué)裂解法： 溴化氰法：專一性斷裂蛋氨酸羧基形成的肽鍵,可得到合適大小的肽片斷,Cyanogen bromide(溴化氰法）,肽段氨基酸序列的測定,Edman降解法：一次可連續(xù)測定6070個氨基酸；程序復(fù)雜，工作量大； 酶降解法： 質(zhì)譜法：,Edman 降解法測定N-末端氨基酸,Edman reagent,PTC-多肽,少一個N-末端氨基酸的肽鏈,層析色譜鑒定,重復(fù),與DNS法聯(lián)合,肽片斷在多肽鏈中排列次序的確定 (見p179),多肽鏈中二硫鍵位置的確定,多肽鏈氨基酸系列的直

18、接測定：最初于1954年由英國劍橋大學(xué)的Sanger實驗室建立；現(xiàn)主要由編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序推導(dǎo). 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫 美國生物醫(yī)學(xué)基金會的PIR (Protein Information Resource or Protein Identification Resource); 美國政府的Gen Bank (Gene Sequence Data Bank) 歐洲的EMBL (European Molecular Biology Laboratory Data Bank)（歐洲分子生物學(xué)實驗室數(shù)據(jù)庫） 可從“Altas of Protein Sequence and Structure”(蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖冊）中查找,同源蛋白質(zhì)：生物體內(nèi)行使相同或相似功