1、缺血性心臟病(心絞痛、心肌梗死)藥,一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ) 根據(jù)缺血性心臟病(心絞痛、急性心肌梗死)的主要癥狀發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)將其歸屬于“厥心痛”、“真心痛”、“胸痹”范疇。病位以心腎為主?；静C(jī)為本虛標(biāo)實(shí)。本虛以臟氣虧虛為主可兼陰虛；標(biāo)實(shí)以血瘀痰阻多見，可兼氣滯、寒凝?；局畏樾酝枺钛?，芳香溫通及扶正固本。 缺血性心臟病可由不同病因引起，最常見的原因是冠狀動脈粥樣硬化、冠狀動脈血栓及冠狀動脈痙攣。其共同特點(diǎn)是由于心肌供血不足所致氧的供需矛盾而發(fā)生的一系列病理生理改變及證候。 改善心臟血管功能，增加心肌的供血供氧，降低氧的消耗，改善心肌代謝，緩解心絞痛，減小心肌梗死面積是藥物治療的主要

2、目的。 二、藥效學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 缺血性心臟病需要進(jìn)行的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)較多，般應(yīng)以整體動物實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)藥物特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)要求適當(dāng)選用器官、組織、細(xì)胞及分子水平的實(shí)驗(yàn)，多層次實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，有利于重復(fù)驗(yàn)證和說明作用原理。但由于缺血性心肌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，防治的途徑，方法及藥物類型亦較復(fù)雜。應(yīng)明確研究的思路，作用的途徑，選擇適宜的主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)方法及必要的觀測指標(biāo)，進(jìn)行止確的分析判斷，以求得科學(xué)的結(jié)論。,(一)對心肌缺血心肌梗死的防治作用試驗(yàn) 1常用動物模型 (1)冠狀動脈阻斷或縮窄形成心肌缺血和心肌梗死模型：通過阻斷或縮窄冠狀動脈方法，如結(jié)扎、電刺激、氣囊法，血管內(nèi)異物法及注入凝血酶或ADP法等。 (2)藥

3、物誘發(fā)心肌缺血模型：通過藥物誘發(fā)冠脈痙攣法，如垂體后葉素、麥角新堿，以及通過增加心肌耗氧法，如異丙腎亡腺素等。 (3)離體實(shí)驗(yàn)心肌缺血模型：結(jié)扎離體心臟冠狀動脈法、離體心臟低氧或無氧灌流法。 (4)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺血樣損傷模型：控制心肌細(xì)胞的供氧和培養(yǎng)基中的含糖量，形成“缺血樣損傷”模型。 (5)心肌缺血冉灌注損傷模型：整體動物心臟缺血再灌注損傷離體心臟和心肌細(xì)胞缺氧缺糖再灌注損傷等模型。 以上心肌缺血模型第一項(xiàng)可用于急性和慢性心肌缺血實(shí)驗(yàn)，可觀察藥物的藥理作用、起效及作用時間等。其余均為急性心肌缺血模型，可作藥物作用機(jī)制分析研究。,2觀察指標(biāo) (1)直接測定心肌梗死范圍：大體標(biāo)本活體染色法

4、，以定量組織學(xué)(NBI染色或TIC染色或雙重染色)觀察心肌梗死面積的改變。病理切片顯微鏡檢查，鏡下觀測心肌病變程度和范圍。病理切片熒光照相法，利用四環(huán)素能與心肌壞死細(xì)胞中的鈣整合的特性，在切片上進(jìn)行熒光照相，以測定梗死面積。電子顯微鏡觀察細(xì)胞膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核及染色質(zhì)等心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 (2)間接測定心肌梗死范圍：心外膜電圖標(biāo)測法，阻斷或縮窄冠狀動脈形成心肌缺血及心肌梗死，以多點(diǎn)心外膜電圖標(biāo)測心肌缺血的程度和范圍的變化。酶學(xué)指標(biāo)觀測，測定血中磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)等與心肌損傷相關(guān)的酶類變化，動態(tài)觀察心肌損傷情況，定量分析心肌損傷程度。核示蹤法，將肘心肌壞死

5、有親和力的物質(zhì)進(jìn)行核索標(biāo)記來觀察梗死情況，常用的有锝四環(huán)素和锝焦磷酸亞錫。,(3)缺血區(qū)測定指標(biāo)：染料及熒光素法，通過從冠脈注入染料或熒光素，然后進(jìn)行肌切片觀察心臟血流灌注情況，從而計(jì)算無染料(或熒光)的面積(即缺血面積)，如合并應(yīng)用NBT做活體雙重染色法可計(jì)算梗死面積與缺血面積的比值。核示蹤法，利用放射核鉈依靠鈉泵進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)而不能進(jìn)入缺血或壞死細(xì)胞的特點(diǎn)，通過閃爍照相來觀察心肌缺血部位及范圍。放射自顯影法觀察缺血區(qū)。心表面熒光法，用表面熒光照相來分析缺血K情況。冠脈血流量、冠脈返流量及返流壓的測定。心肌區(qū)域血流量的測定。 (4)其他可供分析的指標(biāo)：心肌代謝指標(biāo)，如心肌氧代謝，其他物質(zhì)及能量代謝

6、，如FFA、ATP、PGI2、TXA2、cAMP/cGMP，SOD、MDA、乳酸、鉀、鈣、鎂離子、血凝狀態(tài)及血液流變性等。,3方法學(xué)評價 以上各項(xiàng)試驗(yàn)方法中，以阻斷動物的冠狀動脈所致之局限性心肌缺血是目前國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的方法，通過狹窄或完全閉塞冠狀動脈，使其供應(yīng)區(qū)的血流減少或缺無，造成心肌缺血，心肌因缺血、缺氧而發(fā)生代謝紊亂，以致發(fā)生凝固性壞死，其發(fā)病過程和機(jī)制與臨床相似，與中醫(yī)理論“瘀血證”有一定聯(lián)系，較為合理、實(shí)用?？筛鶕?jù)所試藥物功能、主治和作用特點(diǎn)選用上述形態(tài)、電生理、生化、放免、核示蹤、熒光等觀測指標(biāo)與方法，可以定位、定性、定量的觀測缺血心肌的動態(tài)變化及藥物影響，較為準(zhǔn)確的評價藥效。

7、應(yīng)作為新藥主要藥效學(xué)的首選試驗(yàn)。,(二)對心臟血流動力學(xué)及心肌耗氧量影響試驗(yàn) 1實(shí)驗(yàn)動物與觀測指標(biāo) (1)犬心功能及血流動力學(xué)實(shí)驗(yàn)：觀察指標(biāo)應(yīng)包括心電圖、心率。動脈血壓、冠脈流量，冠脈阻力、心輸出量、心肌收縮力、左室做功、左室內(nèi)壓、左室內(nèi)壓最大上升速率、心搏出量、心臟指數(shù)、心搏指數(shù)、總外周阻力等，并可同時測定心肌耗氧量、氧利用率、耗氧指數(shù)等。 (2)貓、鼠等其他動物心功能及血流動力學(xué)試驗(yàn)：觀察指標(biāo)應(yīng)包括心電圖、心率，動脈血壓、心輸出量、左室內(nèi)壓、左室內(nèi)壓最大上升速率、中心靜脈壓、左室別血的張力指數(shù)、左室作功指數(shù)、心臟指數(shù)、左室舒張未期壓等。 (3)無創(chuàng)性心功能檢查：如超聲心動圖、阻抗圖、Y照相

8、等。 2方法學(xué)評價 心臟血流動力學(xué)、心肌耗氧量等應(yīng)作為評階藥物作用及作用機(jī)制的重要指標(biāo)，對于了解藥物對心肌功能、血管順應(yīng)性、心肌供血及心肌氧代謝的影響，結(jié)合對心肌缺血、心肌梗死等指標(biāo)的影響，作綜合性評價有重要意義。,(三)其他試驗(yàn) 1血小板聚集性試驗(yàn) 血小板聚集性增強(qiáng)是造成血液循環(huán)障礙導(dǎo)致心肌缺血發(fā)生的重要原因之一。藥物對動物血小板聚集性的影響可作為藥效學(xué)研究的輔助指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)動物用兔或大鼠。以三磷酸腺稈、花生四烯酸(AA)、膠原、凝血酶等作為繡導(dǎo)劑，應(yīng)用比濁法或其他方法測定。 2血栓形成及溶栓試驗(yàn) 冠狀動脈血栓形成是直接導(dǎo)致心肌缺血因素之一。對血栓形成的影響和溶栓作用應(yīng)為評價治療心肌缺血藥物藥

9、效的輔助指標(biāo)。常用免或大鼠以Chmldlcr血栓形成法，測定心栓的重量及長度；應(yīng)用大鼠以動靜脈旁路法測定血栓濕重；電刺激人鼠頸總動脈形成動脈血栓，用以觀察藥物對體內(nèi)血栓形成時間的影響;電刺激犬或豬的冠狀動脈形成冠狀動脈血栓，以心肌缺血程度范圍、心肌梗死、心肌酶及冠脈血栓占管腔的百分比等多項(xiàng)指標(biāo)綜合觀察藥物對心肌缺血的防治作用和溶栓作用。,3血液流變學(xué)試驗(yàn) 心肌缺血發(fā)生前后，常伴有血液流變學(xué)改變。因此，測定血液黏度、血漿纖維蛋白原含量、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞沉降、血小板黏附和聚集等血液流變學(xué)指標(biāo)，對評價藥物的作用有重要意義。 4氧代謝試驗(yàn) 增加心肌的供氧和提高心肌的耐缺氧能力，改善心肌能量代謝是藥物

10、治療缺血心臟病的重要作用。方法除前面介紹的心肌耗氧量測定外，可同時選用小鼠常壓、低壓耐缺氧等實(shí)驗(yàn)和指標(biāo)。,(四)陽性對照藥 陽性對照藥既可選擇西藥，也可選中藥。西藥作用明確，療效肯定，尤其是一些經(jīng)典藥品，可檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法可靠性。西藥劑量與中藥量相差較大，作用特點(diǎn)亦不大相同，不做藥效強(qiáng)度比較。采用中藥陽性藥時，一股應(yīng)選療效肯定的功能主治相似的中成藥對照，對照藥應(yīng)是藥典記載或經(jīng)衛(wèi)生部批準(zhǔn)生產(chǎn)的；對照藥劑應(yīng)與受試藥等效或相當(dāng)，以便進(jìn)行比較，同一受試藥的不同藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)選用不同的陽性對照藥。,三、動物模型建立方法 (一)犬或小型豬心肌缺血及心肌梗死模型 1原理 通過縮窄或完全閉塞冠狀動脈，減少或停止供應(yīng)區(qū)

11、的血流，形成心肌缺血、缺氧而發(fā)生代謝紊亂，以致發(fā)生心肌壞死。 2方法 健康成年犬或小豬(現(xiàn)我國已培育出實(shí)驗(yàn)用“中國實(shí)驗(yàn)小型豬”)，雌雄兼用，體重1015kg，經(jīng)戊巴比妥鈉(30mg/kg)靜脈麻醉，手術(shù)臺固定，分離氣骨并插管，連接電動呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)潮氣量300600wi，動脈氧分壓維持在1213kPa(90-100mmHg)，血pH在正常范圍；左側(cè)第四肋間開胸，暴露心臟，剪開心包，做心包床；分離冠狀動脈左前降支中段(一般相當(dāng)廠第三分支根部)，可用以下兒種方法阻斷冠狀動脈，形成心肌缺血： (1)冠狀動脈結(jié)扎法：在冠脈分離處穿34號處線以備結(jié)扎，或用動脈夾阻斷，一般用于急性心肌缺血實(shí)驗(yàn)。 (2)冠狀

12、動脈血栓形成法：將弧型針狀電極(刺激電極)置于分離的冠狀動脈下，另一電極(參考電極)距刺激電極o6mm處置于心外膜下，兩電極分別連接電刺激儀的隔離器正負(fù)極，以25、lmA直流電刺激冠狀動脈30min左右，冠狀動脈內(nèi)血栓形成，阻斷冠狀動脈血流，誘發(fā)心肌缺血。,(3)冠狀動脈氣囊壓迫法：壓迫環(huán)由有機(jī)玻璃外套和可膨脹的乳膠小囊構(gòu)成，外套長5mm側(cè)面lmm的縫隙，血管由此進(jìn)入肺內(nèi)，小囊長34mm，一端密閉，一端與塑料管相連，充滿蒸餾水或生理鹽水，經(jīng)塑料管注水3040ul使小囊膨脹以壓迫套內(nèi)的血管，當(dāng)壓力去除時，小囊恢復(fù)原狀，冠狀動脈重新通暢，適用于急性和慢性心肌缺血或再灌實(shí)驗(yàn)。 (4)Ameroid縮

13、窄環(huán)法：為形成慢性冠狀動脈閉塞、心肌缺血或觀察冠狀動脈側(cè)支循環(huán)的變化，用具有吸水性的塑料環(huán)(Ameroid環(huán))套在冠狀動脈左旋支根部。關(guān)閉胸腔后，塑料環(huán)吸收組織水分膨脹，環(huán)外殼系硬質(zhì)材料做成，限制環(huán)的外展，結(jié)果壓迫冠狀動脈，形成心肌缺血。環(huán)植人46星期，血骨內(nèi)徑縮小80-90。 (5)清醒動物心肌缺血實(shí)驗(yàn)：將氣囊壓迫環(huán)固定在冠狀動脈適當(dāng)部位，縫合心包，放置心包膜電極，氣囊的導(dǎo)管電極的導(dǎo)線分別穿過胸壁引出皮外，逐層縫閉胸。實(shí)驗(yàn)時注入蒸餾水，使氣囊膨脹，壓迫冠狀動脈造成心肌缺血，測量心外膜電圖或其他觀察指標(biāo),本法可反復(fù)阻斷冠狀動脈，進(jìn)行多次清醒動物的心肌缺血實(shí)驗(yàn)及再灌注損傷實(shí)驗(yàn)。 (6)缺血再灌注

14、創(chuàng)傷：在心肌缺血一定時間造成心肌損傷后，冉供血一定時間，加重心肌損傷而形成再灌注損傷，觀察藥物的保護(hù)作用。,3藥物療效判斷 (1)心外膜電圖標(biāo)測：心外膜標(biāo)測點(diǎn)的定位應(yīng)包括缺血中心區(qū)、邊緣區(qū)和非缺血區(qū)，標(biāo)測方法：將心電極固定于具有一定彈性的無刺激性材料作成的片子上，該片四角縫于心外膜，如多點(diǎn)固定式心外膜電極?；蛑苯訉⒚總€電極固定于心外膜表面，或用一個燈芯電極按順序點(diǎn)測標(biāo)測點(diǎn)?；蛴靡粋€電極沿心表山一定途徑移，記出一個連續(xù)的心外膜電曲線。電極用浸泡生理鹽水的燭芯棉線或細(xì)毛筆尖等柔軟材料探查電極，聯(lián)于心電圖胸前導(dǎo)聯(lián)描記，用普通心電圖機(jī)或多導(dǎo)生理記錄儀記錄。確定心肌缺血以ST段抬高作為指標(biāo)，以ST段抬高

15、2mv的點(diǎn)數(shù)(NST)代表心肌缺血的范圍，以各點(diǎn)段抬高的毫伏數(shù)之和(ST)代表心肌缺血的程度。記錄阻斷冠脈血流前后的變化及藥物的影響。,(2)缺血區(qū)及梗死區(qū)面積的測定：在阻斷冠狀動脈血流孔后，經(jīng)左心耳根部向心房注人碳索墨水15mlkg，20-30s注完，迅速取下心臟，冰凍3040min，在冠狀動脈結(jié)扎線下平行冠狀溝等厚度將心室部分橫切成5片，分別稱重，再用求積儀或電腦圖分析儀測量每片心肌兩面的墨水染色區(qū)與末染區(qū)(缺血區(qū))，計(jì)算心肌缺血范圍的重量及百分比。然后將5片心肌置硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染液中，震搖染色15min后取出，正常心肌染為暗藍(lán)色，梗死區(qū)心肌則小著色或淺黃色，用求積儀或落點(diǎn)求積法或

16、電腦圖像分析法測量每片心肌兩面的梗死區(qū)和非梗死區(qū)，計(jì)算出每片心肌總面積、總重量；缺血區(qū)和梗死面積和重量；計(jì)算缺血區(qū)占心室百分比，梗死區(qū)占心空白分比，及梗死區(qū)占缺血區(qū)百分比，以評價藥物的療效。,(3)生化指標(biāo)：阻斷冠狀動脈前后定時抽取血液，測量血中乳酸脫氫酶的變化，分析心肌損傷情況。為避免具他肌肉組織釋放的酶干擾，測同工酶。 同時可測定血ATP、cAMPcGMP、無機(jī)離子、代謝物、能量代謝物質(zhì)等，如需了解藥物作用與前列腺素的關(guān)系，可觀察PGl2或代謝產(chǎn)物的變化，以觀察藥物對的影響。如需了解藥物與氧自由基的關(guān)系，可測定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)作為氧自由基產(chǎn)生和清除的觀測指標(biāo)。 (

17、4)血液流變性指標(biāo)測定：阻斷冠狀動脈前后定時抽取血液，測定全血黏度、血漿纖維蛋白原含量、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞沉降率、血小板黏附和聚集性等血液流變學(xué)指標(biāo)。,4 注意點(diǎn) 犬和小型豬是建立心肌缺血模型最常用的動物，其體積大小適中，性情溫順、易訓(xùn)練、心臟解剖及生理特點(diǎn)與人相似，其影響因素有： (1)動物冠狀動脈分支及側(cè)支循環(huán)有個體差異，對分支及側(cè)支變異大的，不合標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)剔除不用，各組動物模型心肌缺血程度和范圍接近。 (2)正式實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)熟練掌握動物開胸手術(shù)和冠狀動脈分離手術(shù)，盡量減少出血，做心包床時，心肌不應(yīng)移位而影響心臟的正常舒縮功能。 (3)實(shí)驗(yàn)時應(yīng)嚴(yán)格控制心外膜電極的位置、壓力，心臟表面的溫度、濕

18、度及位置。心外膜電極放置的位置，或反復(fù)測定的位置應(yīng)準(zhǔn)確固定，不應(yīng)移位。電極不可對心臟壓力過大，心臟表面的溫度及濕度應(yīng)穩(wěn)定，不可干燥。否則將影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 (4)實(shí)驗(yàn)可注射給藥，但口服中藥消化道給藥，消化道灌胃給藥或十二指腸給藥，灌胃時，注意動物提前812h禁食。 (5)在進(jìn)行本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)時一定要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，排除干擾因素，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果。必要時同步測血氧、pH等。,(二)大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌梗死模型 I，原理 結(jié)扎大鼠的冠狀動脈前降支，阻斷其分布區(qū)域的心肌供血，心肌細(xì)胞長時間缺血缺氧而造成不可逆損傷和壞死。 2方法 取體重200250g雄性大鼠，乙醚吸入或戊巴比妥鈉腹腔麻醉，仰臥固定，氣管插管，在

19、胸骨側(cè)作2cm的縱切口，近胸骨側(cè)剪斷第三第四肋軟骨，打開胸腔，聯(lián)接呼吸機(jī)(通氣量2mll00g，50次min)。剪開心包膜，暴露心臟，冠狀動脈左前降根部穿線以備結(jié)扎，記錄標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖，穩(wěn)定10min，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，關(guān)閉胸腔，用針筒或橡皮吸引吸出動物喉部分泌物，使動物恢復(fù)呼吸。,3 測定指標(biāo) (1)心電圖ST段及Q波標(biāo)測：記錄標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖及胸前導(dǎo)聯(lián)心電圖，測ST、病理性Q波、嚴(yán)重心律失常等指標(biāo)。 (2)測定血漿生化指標(biāo)：如IDH、CPK、ATP、cAMPcGMP、PGI2TXA2等。 (3)梗死面積估算：處死動物，取心臟橫切數(shù)片，測梗死面積，方法同前，但誤差較大?？捎檬腊そM織塊切

20、片，染色，顯微鏡下觀測，分級定度或用定量組織學(xué)方法直接算心肌梗死面積。 4注意點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)方法在一般實(shí)驗(yàn)室條件均可進(jìn)行，方法簡便，但動物較小，操作不便，耐受缺氧時間不長，心臟較小，實(shí)驗(yàn)誤差較大，可作為輔助試驗(yàn)。手術(shù)者必須熟悉冠狀動脈的分布和解削位置，便于定位。操作者嚴(yán)格訓(xùn)練操作熟練，手術(shù)時間不宜過長，部分結(jié)扎冠狀動脈后ECG無改變者需剔除。,(三)心肌缺血再灌注損傷模型 1原理 心肌經(jīng)一定時間缺血(缺氧)后，突然恢復(fù)血(氧)供，形成更嚴(yán)重?fù)p傷，即“心肌缺血再灌注損傷”，其形成原因可能是心肌恢復(fù)血流時，加速細(xì)胞膜內(nèi)外的鈉鈣交換，大量鈣離子進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)，形成“鈣超載”：心肌細(xì)胞發(fā)生“拘縮”而喪失功能。

21、心肌缺血再灌注損傷模型既可用于整體動物，又能用于離體心臟和體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞。在藥效學(xué)研究可根據(jù)所試藥物的藥理作用及作用特點(diǎn)，選用不同的動物和模型。 2 方法 (1)在體心臟心肌缺血再灌注損傷模型：實(shí)驗(yàn)可用多種動物如，犬、小型豬、貓和大鼠等。一般采用阻斷局部冠狀動脈血流一定時間，然后恢復(fù)冠脈血流，形成再灌注損傷。手術(shù)方法觀察指標(biāo)大致同前。,(2)離體心臟缺血再灌注損傷模型：實(shí)驗(yàn)一般用成年Wistar種雄性大鼠，猛擊動物頭部使昏迷，快速開胸，摘取心臟、立即放人4改良Krebs-Hensleit液中，主動脈插管，裝于Leaigendorff罐流裝置，以KH液(pH74)恒溫37進(jìn)行灌流。將兩電極分別

22、于主動脈及左心室壁，記錄心表面電圖。 實(shí)驗(yàn)程序：預(yù)備灌流期，心臟正常灌流(正常改良KH液)，穩(wěn)定l0min，給藥灌流(含不同藥物的改良K-H液，實(shí)驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行)5min。缺血期，以00號線于左心耳部下力進(jìn)針，從肺動脈圓錐旁穿出，結(jié)扎冠狀動脈10min。復(fù)灌期，剪斷結(jié)扎線，進(jìn)行再灌注15min。,3 觀察指標(biāo) 心表面電圖，記錄復(fù)灌后5min出現(xiàn)的室性早搏PVC個數(shù)對數(shù)值lgPVC及室速與室顫總時對數(shù)值。心肌丙醛(ADA)含量及越氧化物歧化酶(s0D)活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剪下再灌區(qū)全層心肌約02g，制備勻漿進(jìn)行測定。心肌離子含量測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以無鈣沖洗液(三羥甲基氨基甲烷緩沖掖)沖洗心肌，取再灌區(qū)

23、層心肌約o 2g，干燥至恒重，以硝酸消化溶解，無離子水稀釋至所需濃度，原子吸收分光光度汁或等離子休發(fā)射光譜儀測定鈉，鉀、鈣，鎂等離子含量。心肌梗死面積測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，將心臟橫切染色，計(jì)算心肌梗死面積。,(四)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺血樣損傷模型 1原理 通常應(yīng)用Wistar種大鼠乳鼠進(jìn)行原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)，用缺氧缺糖形成缺血樣損傷。心肌細(xì)胞缺氧缺糖后，功能從形態(tài)有明顯改變，如胞漿泡形成，胞漿顆粒增加出現(xiàn)異形心肌細(xì)胞等；經(jīng)活體染色證實(shí)細(xì)胞死亡數(shù)增加；搏動頻率下降，動作電位改變；胞漿的乳酸脫氫酶，羥酸脫氫酶及磷酸肌酸肌酶大量漏出等、可利用這些指標(biāo)評定藥物對心肌細(xì)胞缺血樣損傷的保護(hù)作用。,2方法 取出生2

24、3曰乳鼠，開胸、取心室，放人盛有Eagle培養(yǎng)皿中，反復(fù)沖洗3次，三角燒瓶中用眼科剪將心室組織剪成碎塊，加入006胰蛋白酶溶液。在攪拌器上37水浴消化10min自然沉淀后，丟上消液，沉淀的組織塊再加入胰蛋白酶，消化l0min，然后吹打1min，自然沉淀，上清移人離心骨中。加入等量冷培養(yǎng)基以終止消化，離10min(2000rmin)，棄上清，再加入適量培養(yǎng)基于離心管內(nèi)的細(xì)胞沉淀中，混勻，離心，棄上清以洗殘存的胰蛋白酶，加入15Eagle培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液。將自然沉淀的組織塊反復(fù)消化數(shù)次，直至完全分散為止。將各次消化制的細(xì)胞懸液集中，制成心肌細(xì)胞懸液，接種至玻璃培養(yǎng)瓶，塞緊，37c下靜置單層培養(yǎng)

25、或在二氧化碳培養(yǎng)鞘開放培養(yǎng)。 體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧缺糖性損傷模型的建立方法：取培養(yǎng)3日的心肌細(xì)胞，按下法進(jìn)行缺氧缺糖實(shí)驗(yàn)缺糖：實(shí)驗(yàn)時采用無糖液或不含糖的Eagle培養(yǎng)基代替正常培養(yǎng)。缺氧：將無糖Hanks液或無糖培養(yǎng)基預(yù)先用純氮?dú)?99.999)飽和15min；實(shí)驗(yàn)時換人這種缺氧缺糖液或培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶內(nèi)再充人氮?dú)?1l/min)30s以置換瓶內(nèi)空氣，然后塞緊瓶塞。正常對照組用正常Hanks液或培養(yǎng)基，不充氮?dú)?，如用二氧化碳培養(yǎng)箱加以培養(yǎng)，則通人95N2+5C02氣體形成缺氧。也可在缺氧后再供氧，形成冉供氧損傷，開觀察藥物對供氧損傷的影響。,3測定指標(biāo) (1)形態(tài)學(xué)觀察：用臺盼蘭染色進(jìn)行死活細(xì)胞

26、鑒定，觀察細(xì)胞活力的改變及死亡比例，光學(xué)顯微鏡下可觀測心肌細(xì)胞形態(tài)變化，如偽足變化、胞泡形成、胞漿顆粒增加、異形(長形、紡錘形)心肌細(xì)胞的出現(xiàn)。在掃描或透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)的變化。 (2)心肌細(xì)胞搏動的變化：包括搏動的頻率、節(jié)律及強(qiáng)度等。 (3)胞漿酶的釋放：可用生化或細(xì)胞化學(xué)方法測定缺氧缺糖后心肌細(xì)胞內(nèi)從培養(yǎng)基中酶的變化，如IDH、CPK、羥酸脫敏酶、轉(zhuǎn)氨酶等的變化。 (4)其他：測定細(xì)胞內(nèi)氧化物歧化酶的變化從鈣離子運(yùn)轉(zhuǎn)等。 上述觀測指標(biāo)綜合選用，以判斷心肌細(xì)胞損傷程度及藥物保護(hù)作用。,4方法學(xué)評價 優(yōu)點(diǎn)：觀察藥物對心肌細(xì)胞的直接作用，可排除藥物通過其他間接影響心肌缺血氧的作用。節(jié)約藥物，

27、適用于分離或合成得到的極少藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。適用于從細(xì)胞或分子水平進(jìn)行機(jī)制研究。 局限性：技術(shù)設(shè)備要求高。不適于觀察不溶于水或含雜質(zhì)的粗制藥物，或非直接作用心肌細(xì)胞的藥物的作用。因此，本法應(yīng)與整體或器官水平的實(shí)驗(yàn)配合進(jìn)行，以便更全面的判斷藥效。,(五)藥物誘發(fā)心肌缺血模型 近年研究認(rèn)為冠狀動脈痙攣是導(dǎo)致心肌急性缺血的主要原因之致心絞痛、心肌梗死和猝死。目前常用垂體后葉素在整體動物(犬、小型豬、兔、豚鼠，大鼠)或離體心臟上造成冠脈痙攣心肌缺血模型，或用兒茶酚胺類藥物引起心肌缺血的方法，以評價抗心肌缺血藥物的療效。 l、垂體后葉素誘發(fā)心肌缺血模型 (1)原理：垂體后葉素能使冠狀動脈痙攣，造成急性心肌供

28、血不足，從外周阻力增加導(dǎo)致心臟負(fù)荷加重，心電圖可見心肌缺血的典型變化，適用于緩解冠狀動脈痙攣以防治心肌缺血藥物的初篩方法；垂體后葉素能收縮全身(特別是內(nèi)臟)小血管，作用是非特異的。,(2)方法： 大鼠缺血模型：取體重200g健康大鼠，腹腔注射烏拉坦麻醉，仰臥固定，將電極插入四肢及胸前心尖搏動處皮下，調(diào)節(jié)心電圖靈敏度1mV=15mm，紙速為50mm/s，可璉接心電示波器連續(xù)觀察心電變化，記錄胸前導(dǎo)聯(lián)或?qū)?lián)心電圖。實(shí)驗(yàn)前有心電圖或心律失常異常變化，則棄去不用，根據(jù)所試藥物特點(diǎn)選擇適當(dāng)給藥途徑和間隔，靜脈給后15min腹腔注射后1530min，灌胃后1-2h，經(jīng)下靜脈或尾靜脈注射垂體后葉素05或07

29、ukg，注射速度5s或l0s。注射后即刻、5s、10s、15s及30s、lmin、2min及5min，重復(fù)記錄心電圖(記錄時間可據(jù)示波器所示異常情況決定)。 正常大鼠注射腦垂體后葉素后心電圖變化分兩期： 第一期，注射即刻至30s，T波升高，ST段抬高(超過o1mV)，尤以l0s變化最明顯。 第二期，注射后30s至數(shù)分鐘，T波低雙相、倒置，心率變慢，PR及QT間期延長。 判定標(biāo)準(zhǔn)，以出現(xiàn)第一期或第二期缺血變化為陽性，否則為陰性，比較各組的差異，并做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。,家兔缺血模型：健康家兔，體重23kg，在清醒或麻醉狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄胸前導(dǎo)聯(lián)或D導(dǎo)聯(lián)心電圖，耳靜脈30s注入垂休后葉素25ukg，心肌

30、缺血的心電變化急劇，不便判斷藥效，亦可改用靜脈滴注法，即在l0min內(nèi)恒速滴人上述劑量的垂體后葉素，心電圖變化可持續(xù)到1530min，除上述缺血性心電圖變化外，偶有竇性心律失常、室性早搏、室性心動過速等心律失常發(fā)生。 判定指標(biāo)同大鼠。,2，異丙腎上腺素誘發(fā)心肌缺血模型 (1)原理：異丙腎上腺素為受體興奮劑通過加快心率增加心肌收縮力等環(huán)節(jié)，增加心肌耗氧量，造成心臟負(fù)荷過重，心肌微循環(huán)障礙，連續(xù)應(yīng)用可形成心肌損傷，可用心電圖和病理方法觀測病變程度。適用調(diào)節(jié)心肌代謝、氧供需平衡及作用于受體藥物的研究； (2)方法：健康大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、貓或犬均可。經(jīng)心電圖檢查，棄去心電圖有異常改變或心律失常。

31、大鼠、豚鼠和犬每日皮下注射異丙腎上腺素28mgkg，家兔1016mg/kg連續(xù)兩日，第一次和第二次紿異丙腎上腺素后30min內(nèi)，每隔5min記錄心電圖一次，第二次給藥后24h記錄心電圖后殺死動物，取心臟做病理切片檢查。,異丙腎上腺素可引起T波倒置或雙相，有ST段抬高，竇性心動過速(心率明顯加快)，早搏或伴有其他心律失常。心肌病理觀察可見：白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，心肌纖維腫脹、斷裂、橫 紋消失、甚至溶解，發(fā)生玻璃樣變和脂肪變性等。比較各心電圖和病理變化，以判斷藥效。 (3)注意點(diǎn)：適用于研究影響心肌氧代謝平衡或作用受體而防治心肌缺 血的藥物，用心電圖難于定量觀測藥物的作用，須用病理觀測，但制備病理

32、標(biāo)本及觀察 量較大，難準(zhǔn)確定量，是其缺點(diǎn)，可用分級定度或半定量法觀測。,3麥角新堿誘發(fā)心肌缺血模型 (1)原理：動物左冠狀動脈干注入麥角新堿，可誘發(fā)明顯的冠狀動脈痙攣 和血流動力學(xué)改變：平均動脈壓、冠脈壓和肺動脈壓及外周阻力增加，心排出量下降，乙電圖 ST-T抬高，60發(fā)生室性心律失常，左冠狀動脈造影顯示狹窄率達(dá)5075，動脈血氧下 降，血小板聚集和血拴烷增加，前列腺環(huán)素下降，顯示急性心肌缺血缺氧全身高凝狀態(tài) 的病理生理改變：、病理學(xué)證實(shí)，心肌有缺血壞死性改變及冠脈血栓形成。這種動物模型 可用以評價通過緩解冠狀動脈痙攣、攻善血液流變性等多種途徑防治心肌缺血的藥物。 (2)方法：健康犬，體重lo

33、20kg，戊巴比妥鈉30mgkg注射麻酢，自右側(cè)股動脈插入導(dǎo) 管至左冠脈主干，以麥角新堿o.22mgkg于生理鹽水，lmin內(nèi)拄入，可形 成冠脈痙攣及心肌缺血。 (3)觀測指標(biāo)：心電圖或體表標(biāo)測心電圖ST及NST改變。血流動力學(xué) 改變。生化指標(biāo)：CPK、血小板聚集、TXB2、keloPGF等變化。心臟病理學(xué) 改變。 (4)注意事項(xiàng)：本實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)是不開胸，不結(jié)扎冠狀動脈，通過心電圖、血流動力學(xué)、生化 和病理研究以評價抗心肌缺血藥的治療作用。但設(shè)備及技術(shù)要求較高，如血流動力學(xué)的測 定需要帶熱敏電阻的Swan-Gmlg四腔導(dǎo)管等。為簡化實(shí)驗(yàn)方法，可試用貓、兔、大鼠或豚鼠 按照垂體后葉素實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。,

34、(六)心臟血流動力學(xué)實(shí)驗(yàn) 1原理 心肌缺血往往伴隨心臟血流動力學(xué)改變，人部分治療缺血性心臟病的有效藥 物均可改善血流動力學(xué)而發(fā)揮作用。因此，心臟血流動力學(xué)指標(biāo)應(yīng)作為主要藥效學(xué)研 究內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)動物可用犬、小型楮、貓或大鼠，但后兩種動物心臟較小，某些指標(biāo)不宜直接觀 測，犬和小型豬應(yīng)作為首選動物。 2方法 健康犬或小型堵，雌雄兼用，體重12-15kg實(shí)驗(yàn)動物用戊巴比妥鈉(30mgkg) 靜脈麻酐，手術(shù)臺固定，分離氣管并插管，連接電動呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)潮氣量300600ml，動脈氧 分壓維持在如100mmHg，血ph在正常范圍；左側(cè)第四肋開胸，露心臟，剪開心包，做 心包床：分離冠狀動脈左旋及主動脈根部。放置

35、相應(yīng)直徑電磁量計(jì)探頭，分別測量冠脈 血流量及心出量。左心室尖部插管，連接壓力換能器，測定左室內(nèi)壓，再經(jīng)微分惻定左室內(nèi)壓上升最大速率。頸外靜脈插管至冠狀靜脈竇，動脈插管，以血氧測定儀或血?dú)夥治鰞x分別測定冠狀靜脈血氧含量及動脈血氧含量，計(jì)算心肌耗氧量。股動脈插管測定動脈血壓，以肢體導(dǎo)聯(lián)觀測標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)心電圖并計(jì)算心率。公式算其他血流動力學(xué)指標(biāo)：心搏出量、耗氧指數(shù)、心臟指數(shù)、冠脈阻力外周阻力及氧利用率等。將上述各項(xiàng)指標(biāo)同步錄于多道生理記錄儀。 3. 注意點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)難度較大，耍具備成套精密儀器。、實(shí)驗(yàn)人員要經(jīng)過嚴(yán)格訓(xùn)練，盡量減少對心肌功能的影響。分離主動脈根部、冠狀動脈及相應(yīng)電磁換能器、心尖部插管等是手術(shù)成

36、功的關(guān)鍵。,(七)冠脈循環(huán)實(shí)驗(yàn) 1原理 冠脈流量是評價防治心肌缺血藥物的重要指標(biāo)。多年來，國內(nèi)外對擴(kuò)張冠狀動脈的藥物進(jìn)行廣泛、系統(tǒng)、深入的研究：，雖然能增加冠脈血流量的藥物很多，但不一定都有防治心肌缺血的作用。研究中，應(yīng)以多種指標(biāo)綜合分析，了解平衡兩方面的變化，特別是凈效應(yīng)，才能獲得準(zhǔn)確的結(jié)論。冠脈流量測定分兩種：即整體冠脈流量的測定和離體冠脈流量的測定。為了解藥物對缺血區(qū)心肌實(shí)際供血情況，可在整體實(shí)驗(yàn)動物中進(jìn)行冠脈側(cè)支循環(huán)、心肌區(qū)域血流量、心肌營養(yǎng)血流的研究，從不同角度反映藥物對冠脈循環(huán)的影響及防治心肌缺血的療效。,2方法 (1)犬冠脈循環(huán)實(shí)驗(yàn)法：冠脈血流量測定，手術(shù)方法與步驟同心臟血流動力

37、學(xué)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動物開胸完成后，分離冠狀動脈左旋支，放置適宜電磁流量探頭，測量冠脈血流量測定動脈血壓。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取下心臟稱重，以13心重作為冠脈旋支血流供血區(qū)域，計(jì)算每100g心肌每lmin血流量。 冠脈側(cè)支循環(huán)研究方法：實(shí)驗(yàn)用健康成年犬，手術(shù)同前，開胸手術(shù)完成后，分離上動脈根部。放相應(yīng)直徑電磁流量計(jì)探頭測量心輸出量。在冠脈左前降支下13處，分離并結(jié)扎冠狀動脈，于遠(yuǎn)端插入冠脈插管。分離頸總動脈插管，與冠脈插管相連形成旁路，灌注前降支遠(yuǎn)端。三通的第三臂接橡皮臂，以收集反流量，測量反流壓。插前，靜脈注入肝素750ukg。分離股動脈，插入動脈管，記錄動脈血壓。實(shí)驗(yàn)開始，阻斷須總動脈向冠脈左前支的灌流。

38、停灌后10 min，分別記錄心輸出量、冠脈反流量及反流壓，動脈壓及心率，作為給藥前對照值，然后給予實(shí)驗(yàn)藥物。給藥后不同時間，分別紀(jì)錄各值，反流量推算單位壓力差下冠脈惻支血管流量(CVC)=反流量動脈舒張壓，以此反映側(cè)支血流阻力變化。,(2)冠狀靜脈竇血流量測定：通過測量冠狀靜脈竇血流量，反映冠脈血流量的變化，約60的冠脈血經(jīng)冠脈竇流入右心房。利用冠狀靜脈竇插管直接抽血測定血氧含量，計(jì)算出心肌耗氧量及氧攝取率。 注意事項(xiàng)：本法研究藥物對犬或貓的冠狀靜脈竇流出量、心肌耗氧量的影響，簡單方便，作為初篩抗心絞痛藥物，能從供血與耗氧兩力面來評價。,(3)Rb測定心肌營養(yǎng)血流量：冠脈血流除了通過毛細(xì)血管為

39、心肌提供營養(yǎng)性血流外，一部分血流經(jīng)動靜脈吻合支分流人靜脈，兩者構(gòu)成冠脈總血流量。為尋找治療冠心病藥物，觀測心肌營養(yǎng)性血流量及冠脈總血流兩者配合更有意義。銣與鉀為同族元素，理化性質(zhì)相似，均可通過血流進(jìn)入心肌胞，血流越大，撮取量越多。Rb半衰期為195日，易于測定，對心肌有特殊的親和力，攝取量為骨骼肌的2，5倍，故適用于測定心肌營養(yǎng)血流量。 方法：取體重24g的健康小鼠分組，給藥或?qū)φ账幒蟾粢欢〞r間，根據(jù)待試藥物的藥代動力學(xué)過程確定，從尾靜脈注射RbCl生理鹽水溶液o1ml(400010000脈沖min)，5s注入，注射后30s，立即處死動物，取心臟，用生理鹽水沖洗4次，每次l0ml。然后將心臟置

40、玻璃研缽內(nèi)磨成勻漿，放特制鋁箔小皿內(nèi)，在普通燈下烘干，用射線自動標(biāo)器計(jì)數(shù)。以每個心臟放射性占注入總放射性的分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，觀察小鼠心肌攝取Rb量的多少。 注意：為防污染，全部操作在盤內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后一并處理。Rb量及動物處死時間要準(zhǔn)確，井將心臟的動靜脈全部剪掉。每只動物取心臟時所用剪刀、鑷子齊用套以防不同動物間相干擾。,(4)心肌區(qū)域血流量測定：放射微粒法測定心肌區(qū)域血流量的原理是利用放射性素標(biāo)記的微粒注入左心房，循環(huán)的微粒幾乎全部組織固定，故微粒流人每個器官的量(以放射性表示)與該器官血流成正比。 區(qū)域性心肌血流量的操作方法是用羰化塑料微球懸于含o01吐慍80的生理鹽水內(nèi)，使用的置旋渦混合器I2mi

41、n，取微球500萬，用生理鹽水稀釋到l0ml，10s內(nèi)注入麻醉開胸犬左房導(dǎo)管，再用10ml鹽水沖洗導(dǎo)管：注射微球的同時用恒速泵以6-7mlmin的速度從插人動脈弓的導(dǎo)管連續(xù)取3份參考樣品，每份40s。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時取出心，剔除表面的脂肪、血管與心瓣膜，將左窒壁切割成每份重12g的組織塊，每塊分成內(nèi)膜下、中間與外膜下心肌層。用多導(dǎo)Y能諾分析儀記心肌與參考血樣品的放射。汁算心肌區(qū)域性血流量。 根據(jù)阻斷冠脈前后心肌組織內(nèi)血流量的變化減少25以上者為缺血，減少大于75者為嚴(yán)重缺血區(qū)。用以研究藥物對心肌缺血時不同部位，不問層次的心肌血流量的影響。,(5)離體心臟冠脈灌流法：哺乳動物離體心臟，插管人動脈灌流肘

42、，灌流液須經(jīng)冠狀動脈經(jīng)右心房流出心臟，故流出量可代表冠脈流量，在灌注壓不變的條件下，其流量可反映冠脈阻力的變化。 方法：雄性大鼠，體重200-250g，腹腔注射06戊巴比罷鈉45mgkg麻醉仰位固定，分離側(cè)股靜脈，注入肝素125u，剪開胸暴露心臟，動脈第支頭臂動脈發(fā)出處近端橫斷，速將心臟投入4C灌流液，沖洗冠狀動脈中的殘留血液，將心臟移至lallgendoff灌流裝置F端，以KrebsHenseleit液灌流。待心臟跳動規(guī)則后，在肺動脈起始處剪一小口，以利冠狀血回流液排出。心臟表面放置鉑電極，連接電刺激，用于心臟起搏。灌注約15rain后，連續(xù)測定每分鐘冠脈流量3次：待恒定后開始給藥，H量筒收

43、集流出記錄給藥前后及給藥后每lmin流出量。同叫可測定心肌耗氧星及其他生化指標(biāo)的變化。,注意事項(xiàng)：藥物的pH及無機(jī)離子含量血接近生理值，否則酸性藥液可增加冠脈流量，須用與藥物同樣pH及無機(jī)離子的對照劑。 實(shí)驗(yàn)中供氧，溫度、灌流壓力及灌液PH要固定不變。灌流液必須用新鮮蒸餾水臨時配制。冠脈血管阻力受血管張力影響，受心肌緊張度對心血管支持力的影響。藥物抑制心肌收縮力，可使血管阻力降低冠脈流量增加，假陽性。為排除這種影響，可先心臟纖顫，然后觀察約物對冠脈流量的影響。用6V直流電產(chǎn)生的斷續(xù)感應(yīng)電震直接刺激心臟，或用方形波刺激器刺激，也用交流電刺激引起心纖顫，然后測定每lmin冠脈流量的變化。,(八)心

44、肌氧代謝實(shí)驗(yàn) 在心肌代謝中，氧的供需占有重要地位，供氧不足，耗氧增加是缺血性心臟病的主要矛盾。左心室心肌耗氧量為每分鐘810ml100g(心肌)，工作負(fù)荷增加時每分鐘可達(dá)40ml100g(心肌)。停心肌供氧，經(jīng)3次收縮即出現(xiàn)缺氧，因此，心肌耗氧測定是研究防治冠心病藥物的重要指標(biāo)。心肌氧代謝的研究方法約分為三類。,1直接測定 心肌耗氧星測定，在電磁流量汁測定冠脈血鼓的同叫反復(fù)多次測定動脈血及冠狀靜脈竇血氧量?？捎?jì)算心肌耗氧。心肌氧張力測定，極譜儀的鉑電極插入丌胸犬的心肌，連續(xù)紀(jì)錄心肌氧張力的變化。心肌缺血時內(nèi)膜下血流及氧張力下降甚于心外股，缺血什損傷及壞死也較外層心肌嚴(yán)重，因此，用雙暴露電極測定

45、左心室外內(nèi)膜下氧張力變化以研究藥物的影響，更有意義。能選擇性增加心膜下氧張力的藥物或措施，對缺血性心肌都有保護(hù)作用。這方法儀器昂貴，國內(nèi)尚未廣泛應(yīng)用，離體心臟心肌片或心肌組織及體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞耗氧量測定，離體心臟灌流，分別測定流人液及流小液的含量，可算出心肌耗氧?；蛴猛呤虾粑鳒y定心肌的耗氧量?；驕y氧儀直接測定心肌片的耗氧量。方法簡便，結(jié)果穩(wěn)定。,2 間接測定 張力時間指數(shù)，根據(jù)心肌耗氧量與心臟做功有密切關(guān)系的原理，間接推測心肌耗氧量的變化。 心肌耗氧指數(shù)，根據(jù)左心室需氧量決定于心率及收縮壓的原理，間接推算心肌耗氧量的變化。 正性肌力作用 ，心肌收縮力、心肌縮短速度與心肌耗氧呈線形關(guān)系，凡有正

46、性肌力作用或延長射血時間者，均增加心肌耗氧量，可根據(jù)藥物指標(biāo)的影響推測心肌耗氧量的變化。,3 心肌耐缺氧實(shí)驗(yàn) 增加心肌供血(供氧)或減少能量(氧)消耗，維持能量氧)代謝平衡，可提高心肌耐缺氧能力，國內(nèi)常用耐缺氧實(shí)驗(yàn)綜合評價些藥物的作用。離體心臟灌流耐缺氧實(shí)驗(yàn)，用不同程度的低氧或無氧流液灌流離體心臟，觀察心臟功能、形態(tài)及生化指標(biāo)的變化，可反映離體心臟對不同缺氧程度的耐受能力以及藥物的影響，并可用于受體作用的研究，但易受體外環(huán)境的影響，須嚴(yán)格擰制實(shí)驗(yàn)條件。大鼠心肺灌流耐缺氧實(shí)驗(yàn)，此法除可反映離體心臟的耐缺氧能力和藥物作用外，可同時測定血壓、心輸出、心房壓及靜脈壓等各項(xiàng)指標(biāo)，說明這些因素與心肌耐缺氧

47、之間的關(guān)系以及藥物的作用。實(shí)驗(yàn)方法較前者復(fù)雜，但可獲得較多信息，對藥物研究有定實(shí)用價值。體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞耐缺氧實(shí)驗(yàn)，利用體外的人或動物心肌細(xì)胞，模擬臨床缺血性心臟病形成缺氧缺糖性損傷的細(xì)胞病理模型，用于研究藥物對心肌細(xì)胞缺氧能力的影響與前述方法結(jié)合。可從器官、組織及細(xì)胞水平反映藥物對心肌耐缺氧能力的影響。其他，小鼠常壓或減壓缺氧實(shí)驗(yàn)，方法簡單，應(yīng)用廣，反映整體(特別是腦組織)的耐缺氧能力，但特異性差，不能反映心肌的耐缺氧力，易受鎮(zhèn)靜、催眠或刺激性藥物的影響，出現(xiàn)假陽性。用小鼠或大鼠測定速度、存活時間及死亡時余存氧含量，可以較準(zhǔn)確的反映出整體動物的耗氧速度及藥物的影響，較前者精細(xì)，但亦不能直接說

48、明心肌的耐氧能力，耗氧速度。,4，其他 心肌代謝除氧的攝取利用外，尚包括碳水化合物，脂肪、蛋白質(zhì)等方面。深入研究藥物對這方面的影響，是必要的。酶學(xué)研究如磷酸肌酸酶(CPK)可以定量地反映心肌損傷的程度，乳酸脫氧酶及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)等，也常用以反映心肌損傷度。測定動脈血，冠狀靜脈或缺血區(qū)血液乳酸或鉀的含量，較心電圖及血流動力學(xué)更敏感的反映心肌缺氧程度及藥物的影響。兩者升高說明心肌缺氧。 下面重點(diǎn)介紹幾種常用方法。,(1)心肌耗氧量直接測定法：經(jīng)冠狀靜脈竇和頸總動脈插管，抽取冠狀靜脈和頸總動脈血，以血氧測定儀或血?dú)夥治鰞x直接測定血氧含量算心肌耗氧量。可與實(shí)驗(yàn)中同時測定的其他血流動力學(xué)指標(biāo)如

49、冠脈血流量、血壓、心電圖等連續(xù)描記于生理記錄儀，進(jìn)行比較研究。 方法：健康成年犬，戊巴比妥鈉(30mgkg)靜脈麻醉開胸手術(shù)同前，從頸外靜脈插冠狀靜脈竇，同時頸總動脈插管。藥前及藥后不同時間抽取血樣進(jìn)行血氧測定，與其他血流動力學(xué)指標(biāo)同時紀(jì)錄相比較。 注意事項(xiàng)：熟練掌握冠狀靜脈竇插管技術(shù)，保持導(dǎo)管在冠狀靜脈竇內(nèi)正確位，以保證血流通暢。取血量要適度，避免抽取血量過多而造成缺血。,(2)氧電極測定心肌耗氧率的方法：氧電極怯測定系利用氧在極化電壓下溶解的氧被還原而產(chǎn)生電流。所以當(dāng)測定系統(tǒng)將電極與被測溶液用能通過氣體分子的聚乙烯薄膜隔開后，在一定極化電壓下電極中測的電流量將只反映破測系統(tǒng)彌散過來的氧，故

50、與被測溶液中的氧分壓成正比，與組織的耗氧成反比，從而可以反映組織的代謝活動。 方法：大鼠或家兔隨機(jī)分組，給藥或?qū)φ找汉螅謩e測定心肌耗氧量或結(jié)扎冠狀動脈形成心肌缺血。再經(jīng)定時間后處死動物，取心肌梗死區(qū)及對照區(qū)心肌組織，于冰浴上切、稱重，加入心肌孵液，于37恒溫水浴平衡，然后將孵育液注入測氧儀，測氧分壓，孵育前后的氧分壓差值即為該組織的耗氧值。實(shí)驗(yàn)時，每份樣本檢測23次，取其均值。 注意事項(xiàng)：本法為整體實(shí)驗(yàn)，離體測定，可對正常心臟或缺血心臟進(jìn)行不同部位的心肌耗氧量測定，反映藥物對正常及缺血心肌耗氧的影響，方法簡便，快速、易普及，但影響因素較多，嘛醉、呼吸狀態(tài)及供氧情況，心肌標(biāo)本的處理從測氧條件的

51、控制，儀器的穩(wěn)定性與靈敏以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度的變化等，均可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果作用。,(3)非特異性方法：小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)法 方法：將lo個250ml或500ml的磨口廣口瓶放入鈉石灰10g，上墊濾紙。然后每瓶放人一只小鼠，各組動物分別給生理鹽水或藥物。將小鼠放入瓶后，將徐有凡士林的瓶蓋蓋緊，記錄時間，觀察各組動物存活時間。可用玻璃干燥器代替廣口瓶。用紙板隔為小格，每格放入小鼠一只，干燥器內(nèi)放入一定量的鈉灰或氫氧化鈉氯化鈣等量，用以吸收水分和二氧化碳?；蛴醚b有氧電極的橡皮塞塞緊瓶，使氧電極與瓶內(nèi)氣體接觸，連接測氧儀，可測出瓶內(nèi)氧量變化，反映耗氧速度。 注意事項(xiàng)：此法特異性較差，大腦比心肌對缺氧更為敏感，

52、很多有中樞抑制的藥物或刺激性約物腹腔注入可減少動物活動，降低機(jī)體耗氧量，也能延長存活時間，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。 (4)小鼠低壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)法，本法與常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)法相似，但將小鼠放入密封的低壓容器內(nèi)。,厥脫證藥,一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ) 厥脫證是指邪毒內(nèi)陷或內(nèi)傷臟氣、氣陰耗竭或亡津失血所致的氣血逆亂，正氣耗脫的一類癥證。厥證是指邪熱內(nèi)陷或陰寒內(nèi)盛所致的四肢逆冷病證。脫證為陰陽氣血衰竭的危重證候，厥證由輕轉(zhuǎn)重致脫，脫證早期可為厥，厥脫不同于單純的厥證或脫證，是由厥至脫，厥脫并見的臨床綜合病證，以手足厥冷，大汗淋漓，脈微欲絕，神志煩躁，淡漠或昏迷為臨床表現(xiàn)。臨床厥脫證已有較明確的辨證指標(biāo)和治療準(zhǔn)則。厥脫證

53、分為寒厥證、熱厥證、陰脫證，陽脫證、氣血兩脫和陰陽俱脫證等。厥脫各證互相轉(zhuǎn)化，熱厥證外感溫?zé)岵?，熱毒?nèi)陷高熱致厥，進(jìn)一步發(fā)展，熱毒熾盛、內(nèi)攻臟腑、陰液大耗而致陰脫證，也可熱傷氣陰，陰陽離決，陽氣暴脫而致陽脫證。陽脫證治療以回陽救逆固脫為主；陰脫征治療以益氣養(yǎng)陰固脫為主。根據(jù)辨證原則，可分為氣陰兩虧，陽氣暴脫，真陰耗竭，熱毒熾盛，心氣不足，氣滯血瘀等六型，各型之間可以互相挾雜。 厥脫證的臨床表現(xiàn)相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的各種休克和循環(huán)衰竭。引起的原因多種如久血性、感染性、心源性、創(chuàng)傷性，過敏嚴(yán)重性休克等。休克是一種急性循環(huán)功能不全綜合征，是有效血液循環(huán)不足，使全身組織和重要臟器的血液灌注不足，導(dǎo)致組織缺血

54、缺氧，微循環(huán)淤滯，代謝索亂和臟器功能障礙等一系列改變。,二、藥效學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (一)對厥脫證動物模型的治療作用試驗(yàn) 1常用動物模型 (1)失血性休克模型：用動脈急性放血的方法，急性失血達(dá)總血量的1520時，就發(fā)生休克，待血壓降至53kPa時便達(dá)到難逆性克?？蛇x犬、貓進(jìn)行試驗(yàn)，大鼠及兔較差。 (2)感染性休克模型：用活菌、內(nèi)毒素或膿毒病灶復(fù)制感染性休克模型，可選用小鼠、大鼠，兔、貓，犬等。 (3)心源性休克模型：用理化等有害刺激，損傷心肌，造成局部心肌壞死；結(jié)扎冠狀動脈的主要分支，造成心肌缺血性梗死；將塑料微球注入到冠狀動脈內(nèi)，造成冠狀功脈栓塞；在心導(dǎo)管上附上不銹鋼電極，插入到冠狀動脈，通以

55、弱電流，造成冠狀動脈血栓及心肌缺血性栓塞等造成心源性休克動物模型?？蛇x用犬、貓、小型豬等。,(4)創(chuàng)傷性休克模型：用止血帶造成動物肢體缺血引起創(chuàng)傷性休克；反復(fù)錘動物腿部肌肉；用木板及鉗持續(xù)擠壓動物腿；牽扯腸襻；損傷胸腔器官等均可引起創(chuàng)傷休克。常用動物有小鼠、兔、貓等。 (5)過敏性休克模型：用抗原物質(zhì)致敏動物后，注入相同的抗原，就可引起急劇的休克反應(yīng)。最常用的動物是豚鼠，其次是兔、大鼠、小鼠，犬等。 (6)腸系膜上動脈夾閉性休克模型：夾閉腸系膜上動脈，引起腸道缺血，當(dāng)一段時間后，恢復(fù)血液供應(yīng)，此時即引起休克?？蛇x大鼠、免等。 (7)其他類型休克：燒傷、疼痛、胰島素休克、微循環(huán)障礙、彌漫性血管內(nèi)

56、凝血等動物模型，亦可適當(dāng)選用。 2 觀察指標(biāo) (1)模型動物死亡率：小動物休克模型以休克動物死亡率的影響評價有效性。 (2)相關(guān)指標(biāo)：如與休克病理性情況改善相關(guān)的血流動力學(xué)和血液生化學(xué)等。,3方法學(xué)評價 上述各種方法造成的模型，可根據(jù)新藥的主治和功效選。陽脫證臨床上以神志淡漠、面色蒼白，四肢厥冷，冷汗淋漓為主證，兼息微唇紺，脈微欲絕或不能觸及，血壓下降，尿少，與臨床“陽脫證”的表現(xiàn)相近似的動物模型如：感染性休克晚期、失血休克晚期及心源性休克模型等。氣血兩脫，由急性失血引起，即失血亡陰之脫證，用失血性休克代償期和失代償早期作為氣血兩脫證的動物模型，如為失代償晚期，屬陰陽俱脫證。陰脫證與感染休克脫

57、水癥狀相似，可用腸道致病菌感染動物，造成嚴(yán)重泄瀉，脫水；亦可用內(nèi)毒素或膿毒病灶引發(fā)休克，燒(燙)傷性休克動物亦可作為陰脫型模型。,(二)其他試驗(yàn) 1. 血壓及微循環(huán) 因?yàn)殛柮撟C(亡陽)和陰脫證(亡陰)，均血壓和微循環(huán)異常，必須進(jìn)行血壓從微循環(huán)的觀察。 2. 血流動力學(xué)、心功能及重要內(nèi)臟血流量 藥物對整體動物血流動力學(xué)和心功能以及對心、腦、腎等重要內(nèi)臟血流量的影響，關(guān)系到藥效作用，應(yīng)進(jìn)行這方面試驗(yàn)。 3根據(jù)不同休克動物模型，增加有關(guān)病因的試驗(yàn) (1)治療邪毒內(nèi)陷之脫證的藥物：除進(jìn)行上述有關(guān)休克模型外，還做祛邪相關(guān)的試驗(yàn)，如抑苗、抗病毒、對抗毒索、抗炎、解熱等試驗(yàn)。扶下相關(guān)的試驗(yàn)，如抗應(yīng)激能力試驗(yàn)

58、、免疫功能試驗(yàn)、物質(zhì)代謝試驗(yàn)及內(nèi)分泌功能試驗(yàn)等。 (2)治療心氣十足的藥物：可增加心功能衰竭模型、心功能測定及血流動力學(xué)等有關(guān)試驗(yàn)。 (3)治療與氣脫類似的過敏性休克藥物：或增加過敏試驗(yàn)等內(nèi)容。 (4)治療劇烈疼痛致脫的藥物：可增加鎮(zhèn)痛等試驗(yàn)。 4其他 還有重要臟器血流量如腦、腎及冠狀動脈血流量的測定、自由基測定及各種酶的測定、電鏡微觀結(jié)構(gòu)觀察等對闡明厥脫證藥物的機(jī)制是必需的。,(三)陽性對照藥 陽脫證治療以回陽救逆固脫為上，可用參附湯、四逆湯、參附注射液、參附青注射液等作對照；陰脫證治療以益氣養(yǎng)陰固脫為主，如生脈散、參麥散、生脈注射液、茶麥注射液等作對照。也可用多巴胺等作對照。 三、動物模型

59、建立方法 (一)厥脫癥失血性休克模型 1原理 以動脈急性放血、急性失血達(dá)血量的15-20時，就可發(fā)生休克，待血壓降至53kPa(40mmHg)時便達(dá)到休克。,2 操作方法 將麻醉貓股動脈插管并連接儲血瓶供放血和儲血用，用肝素鈉10mgkg抗凝，開始放血每分鐘為2ml，當(dāng)血壓低于10kPa，改為分鐘O5ml，放血使血壓降至53kPa，此時為失血代償期。如血壓下降，抬高儲血瓶回輸出血液，待儲血瓶內(nèi)最大放血量的40的血液自動回輸機(jī)體時作為失代償朋，總放血量為2030mlkg，此時再將全部放出的血液輸回機(jī)體，同時靜脈注射試驗(yàn)給藥，對照組以等量生理鹽水靜脈滴人。陽性藥組以多巴胺進(jìn)行比較。觀察血壓、呼吸、心電圖、最大放血量、存活率等。 3造模成功指標(biāo)和藥物療效觀察 放血使血壓降至5. 3kPa(40mmHg)，此時為失血代償期，此時給予治療厥脫證新藥，同時輸血液，血壓可回升，動物可存活。 4 注意點(diǎn) (1)放血速度不宜過快，否則會突然死亡。 (2)如動物進(jìn)入失代償期晚期，此時將全部放出的血液輸回機(jī)體，仍有95-98動