1、.,第七章,分光光度法,.,分光光度法是一種基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的一種分析方法，是生命科學中最常用的分析技術(shù)之一。 包括： (1) 可見分光光度法 (2) 紫外-可見分光光度法(主要) (3) 紅外光譜法等,分光光度法(Absorption Photometry),.,特 點,(一) 靈敏度高,分光光度法測定物質(zhì)的濃度下限(最低濃度)一般可達110-3 %的微量組分。對固體試樣一般可測到10-4 10-5 %的痕量組分。如果對被測組分事先加以富集，靈敏度還可以提高1-2個數(shù)量級。,.,一般分光光度法的相對誤差為25%，若使用精密儀器，相對誤差可降至12%，其準確度雖不如滴定分析法

2、及重量法，但對微量成分來說，還是比較滿意的，因為在這種情況下，滴定分析法和重量法準確度更差，甚至無法進行測定。,(二) 準確度較高,.,(三)操作簡便，測定速度快,(四) 應用廣泛,幾乎所有的無機離子和有機化合物都可直接或間接地用分光光度法進行測定。不僅用于定量分析，也可用于某些有機物的定性分析，還可用于某些物理化學常數(shù)及絡合物組成的測定。,.,物質(zhì)對光的選擇性吸收,第一節(jié),.,一、光的基本性質(zhì),1. 光的基本性質(zhì) 光是一種電磁波，具有波粒二象性。 其波長、頻率與速度之間的關系為： 普朗克方程 h：普朗克常數(shù)，其值為6.6310-34Js 普朗克方程表示光的波動性與粒子性之間的關系。 波長越長

3、，能量越低；波長越短，能量越高。,.,2. 單色光和復合光,(1) 單色光：指波長處于某一范圍的光。 (2) 復合光：由不同單色光組成的光。 例如：陽光和白熾燈發(fā)出的光均為復合光,.,3. 電磁波譜,表10-1 電磁波譜(1m=106m=109nm=1010),.,4. 可見光和互補光,(1)可見光:指人的眼睛所能感覺到的光，波長范圍為(400750nm)的電磁波。 (2)互補光:將兩中適當顏色的光按一定的強度比例混合，如果能形成白光，這兩種光稱為互補光。,.,圖10-1 光的互補色示意圖(/nm),.,二、物質(zhì)對光的選擇性吸收,如果我們把具有不同顏色的各種物體放置在黑暗處，則什么顏色也看不到

4、。可見物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色與光有著密切的關系，一種物質(zhì)呈現(xiàn)何種顏色，是與光的組成和物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)有關的。,.,(一)物質(zhì)對光產(chǎn)生選擇性吸收的原因,當光通過透明物體時，光子是否被物質(zhì)吸收。 取決于：光子所具有的能量 物質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu),由于不同物質(zhì)的分子其結(jié)構(gòu)和組成不同，它們所具有的特征能級也不同，故能級差也不同。 物質(zhì)對光的吸收具有選擇性。,.,在可見光區(qū)，不同波長的光具有不同的顏色。當一束陽光(白光)通過棱鏡后就色散成紅、橙、黃、綠等顏色的光，這些光具有不同的波長。 所以不同顏色光，其波長不同，物質(zhì)的顏色正是由于他們對不同波長的光具有選擇性吸收而產(chǎn)生的。 當一束白光通過某一物質(zhì)或溶液時，由于物質(zhì)對光的

5、選擇性吸收，某些波長的光被吸收，另一些波長的光則不被吸收而透過溶液。,(二) 物質(zhì)的顏色與光吸收的關系,.,溶液的顏色由透過光的波長所決定,(1)如果物質(zhì)把各種波長的光完全都吸收，則呈現(xiàn)黑色； (2)如果完全反射，則呈現(xiàn)白色； (3)如果透過所有的光，則為無色透明溶液； (4)如果對各種波長的光吸收程度差不多，則呈現(xiàn)灰色； (5)如果物質(zhì)選擇性地吸收某些波長的光，那么，這種物質(zhì)的顏色就由它所反射或透過光的顏色來決定。,.,例 如：CuSO4溶液,實驗證明： CuSO4溶液濃度越高，對黃色光的吸收越多，表現(xiàn)為透過的藍色越強，溶液的藍色也越深。,.,1. 用不同波長(400-720nm)的光，照射

6、某一吸光物質(zhì)的溶液； 2. 測吸光度(A) 3. 以A作圖，得一曲線 直觀地表示出物質(zhì)對光的吸收特征。,（三）吸收曲線,.,圖10-2 KMnO4溶液的吸收曲線,(c KMnO4 ：abcd ),.,結(jié) 論,1.某物質(zhì)的吸收光譜表明了該物質(zhì)對不同波長的光的吸收能力的分布情況。 2.C、A，即光的吸收程度越大 3.最大吸收處只有一個，稱為最大吸收波長。 即：同一物質(zhì)，只有一個最大吸收峰，即最大吸收波長是固定不變的，該峰對應的波長叫max。 KMnO4溶液的max=525 nm。 定量測定時，必須用max的光照射。 不同物質(zhì)，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同，則吸收曲線不同，max不同。 max只與物質(zhì)的種類有關，

7、而與濃度無關。 任何可見光區(qū)內(nèi)、溶液的顏色主要是由max決定。,.,第二節(jié),光吸收的基本定律,.,一、朗伯-比耳定律,(1) 布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后在1729年和1760年闡明了物質(zhì)對光的吸收程度與吸收層厚度之間的關系； (2) 比耳(beer)與1852年又提出光的吸收程度與吸光物質(zhì)濃度之間也有類似的關系； (3) 二者結(jié)合起來就得到了朗伯-比耳定律。 (4)該定律奠定了分光光度分析法的理論基礎。,.,當一束平行單色光照射到任何均勻、非散射的介質(zhì)(固體、液體或氣體)。 例如：溶液時，光的一部分被介質(zhì)吸收，一部分透過溶液、一部分被器皿的表面反射。則它們之間的關系為：

8、,(一) 朗伯-比耳定律的推導,入射光的強度為I0，吸收光的強度為Ia，透過光的強度為It，反射光的強度為Ir,如果,I0 Ia+It + Ir,.,近似處理,在分光光度測定中，盛溶液的比色皿都是采用相同材質(zhì)的光學玻璃制成的，反射光的強度基本上是不變的(一般約為入射光強度的4)其影響可以互相抵消，于是可以簡化為：,I0 Ia+It,.,推 導,純水對于可見光的吸收極微，故有色液對光的吸收完全是由溶液中的有色質(zhì)點造成的。 當入射光的強度I0一定時，如果Ia越大，It就越小，即透過光的強度越小，表明有色溶液對光的吸收程度就越大。,I0 Ia+It,.,實驗證明,實踐證明，有色溶液對光的吸收程度，與

9、該溶液的濃度、液層的厚度以及入射光的強度等因素有關。如果保持入射光的強度不變，則光吸收程度與溶液的濃度和液層的厚度有關。,.,1760年由朗伯推導出了吸光度于吸收介質(zhì)厚度的關系式：,1. 朗伯定律,.,2.比耳定律,比耳(beer)在1852年提出光的吸收程度與吸光物質(zhì)濃度之間的關系：,.,3.朗伯-比耳定律,如果同時考慮溶液的濃度和液層厚度的變化，則上述兩個定律可合并為朗伯-比耳定律，即得到：,式中:A:吸光度， K:比例常數(shù)，與入射光的波長、物質(zhì)的性質(zhì)和溶液的溫度等因素有關。 It/I0=T:透射比(透光度)， b：液層厚度(cm),光吸收定律的數(shù)學表達式,.,4.朗伯-比耳定律物理意義,

10、當一束平行的單色光垂直通過某一均勻的、非散射的吸光物質(zhì)溶液時，其吸光度(A)與溶液液層厚度(b)和濃度(c)的乘積成正比。 它不僅適用于溶液，也適用于均勻的氣體、固體狀態(tài)，是各類光吸收的基本定律，也是各類分光光度法進行定量分析的依據(jù)。,.,5.朗伯-比耳定律成立的前提,(1) 入射光為平行單色光且垂直照射。 (2) 吸光物質(zhì)為均勻非散射體系。 (3) 吸光質(zhì)點之間無相互作用。 (4) 輻射與物質(zhì)之間的作用僅限于光吸收，無熒光和光化學現(xiàn)象發(fā)生。,.,6.吸光度的加和性,當介質(zhì)溶液中含有多種吸光組分時，只要各組分間不存在著相互作用，則在某一波長下介質(zhì)的總吸光度是各組分在該波長下吸光度的加和。 即：

11、A = A1 + A2 + + An,.,(二)吸收系數(shù)和桑德爾靈敏度,1. 吸收系數(shù),朗伯-比爾定律(A=Kbc)中的系數(shù)(K)因濃度(c)所取的單位不同，有兩種表示方式：,.,當c：g.L-1 b：cm時 K用a表示，稱為吸收系數(shù)， 其單位為L.g-1.cm-1 ， 這時朗伯-比耳定律變?yōu)椋?Aabc,(1) 吸收系數(shù)(a),.,(2) 摩爾吸收系數(shù)(),當c：mol.L-1 ， b：cm時 K用表示，稱為摩爾吸收系數(shù)， 其單位為L.mol-1.cm-1 ， 這時朗伯-比耳定律變?yōu)椋?A bc,.,摩爾吸收系數(shù)()的物理意義,當吸光物質(zhì)的濃度為1molL-1，吸收層厚度為1cm時，吸光物質(zhì)

12、對某波長光的吸光度。,.,摩爾吸收系數(shù)()的性質(zhì), 表示了吸光物質(zhì)的濃度為1molL-1 ，液層厚度為1cm，物質(zhì)對光的吸收能力。 與溶液的濃度和液層厚度無關，只與物質(zhì)的性質(zhì)及光的波長等有關。 在波長、溫度、溶劑等條件一定時 的大小取決于物質(zhì)的性質(zhì)。 是吸光物質(zhì)的特征常數(shù)，不同物質(zhì)具有不同的 。,., 對于同一物質(zhì)，當其他條件一定時(溫度等) ，的大小取決于波長。 = f () 能表示物質(zhì)對某一波長的光的吸收能力。 越大，表明物質(zhì)對某的光吸收能力越強。 當為max， 為max max是一重要的特征常數(shù)，它反映了某吸光物質(zhì)吸收能力可能達到的最高度。,., 常用來衡量光度法靈敏度的高低， max越

13、大，表明測定該物質(zhì)的靈敏度越高 一般認為max 104 L mol-1 cm-1的方法較靈敏。 (所以書寫時應標明波長) 目前最大的的數(shù)量級可達106 如：Cu雙流腙配合物 495=1.5105 L mol-1 cm-1,.,(3) 吸收系數(shù)(a)與摩爾吸收系數(shù)() 的關系,吸收系數(shù)(a)常用于化合物組成不明，相對分子質(zhì)量尚不清楚的情況。 摩爾吸收系數(shù)()的應用更廣泛。, = a M,.,2. 桑德爾靈敏度(Sandell) S,吸光光度法的靈敏度除用摩爾吸收系數(shù)表示外，還常用桑德爾靈敏度S表示。 定義：當光度儀器的檢測極限為A=0.001時，單位截面積光程內(nèi)所能檢出的吸光物質(zhì)的最低質(zhì)量 單位

14、：gcm-2,.,3.桑德爾靈敏度(S)與摩爾吸收系數(shù)()的關系,由桑德爾靈敏度S的定義可得到： A=0.001=bc,.,S 單位：gcm-2,b : cm c : molL-1=mol/103cm3 bc = mol/103cm2 (1) 若再乘以M( g mol-1 )，則為103cm2的截面積光程中所含物質(zhì)的質(zhì)量(g) (2)若再乘已106，則(g)把變成了(g),.,例 題：,用鄰二氮菲分光光度法測鐵。已知溶液中Fe2+的濃度為500 g L-1 ，液層厚度為2cm，在508nm處測得透射比為0.645。 計算：吸光系數(shù) a、摩爾吸收系數(shù) 、桑德爾靈敏度S (MFe=55.85 g

15、mol-1),.,解：,A= - lgT= - lg0.645 = 0.190(三位有效數(shù)字) c = 500 g L-1 =5.0010-4 g L-1 b=2cm,.,(三)標準曲線的繪制及應用,1. 標準曲線 配制一系列已知濃度的標準溶液，在確定的波長和光程等條件下，分別測定系列溶液的吸光度(A)，然后以吸光度為縱坐標，以濃度(c)為橫坐標作圖，得到一條曲線，稱標準曲線，也稱做工作曲線。,.,2. 標準曲線的應用,(1)曲線的斜率為b，由于b是定值，由此可得到摩爾吸收系數(shù) ； (2) 可根據(jù)未知液的Ax,在標準曲線上查出未知液的濃度cx。,A=bc,.,二、引起偏離朗伯-比耳定律的原因,

16、根據(jù)郎伯-比爾定律，當吸收層厚度不變時，標準曲線應當是一條通過原點的直線，即A與c成正比關系，稱之為服從比爾定律。 但在實際測定中，標準曲線會出現(xiàn)向濃度軸彎曲(負偏離)和向吸光度軸彎曲(正偏離)，這種現(xiàn)象稱為對郎伯-比爾定律的偏離。,.,(一) 物理因素,1.單色光不純所引起的偏離,嚴格地講，朗伯-比耳定律只對一定波長的單色光才成立。但在實際工作中，目前用各種方法得到的入射光并非純的單色光，而是具有一定波長范圍的單色光。那么，在這種情況下，吸光度與濃度并不完全成直線關系，因而導致了對朗伯比耳定律的偏離。,.,2.非平行入射光引起的偏離,非平行入射光將導致光束的平均光程b大于吸收池的厚度b，實際

17、測得的吸光度將大于理論值，從而產(chǎn)生正偏離。,.,3介質(zhì)不均勻引起的偏離,朗伯-比耳定律是建立在均勻、非散射基礎上的一般規(guī)律、如果介質(zhì)不均勻，呈膠體、乳濁、懸浮狀態(tài)存在，則入射光除了被吸收之外、還會有反射、散射作用。在這種情況下，物質(zhì)的吸光度比實際的吸光度大得多，必然要導致對朗伯-比耳定律的偏離，產(chǎn)生正偏離。,.,（二）化學因素,1溶液濃度過高引起的偏離,朗伯-比耳定律是建立在吸光質(zhì)點之間沒有相互作用的前提下。但當溶液濃度較高時，吸光物質(zhì)的分子或離子間的平均距離減小，從而改變物質(zhì)對光的吸收能力，即改變物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)。濃度增加，相互作用增強，導致在高濃度范圍內(nèi)摩爾吸收系數(shù)不恒定而使吸光度與濃度

18、之間的線性關系被破壞。,.,2. 化學反應引起的偏離,溶液中吸光物質(zhì)常因解離、締合、形成新的化合物或在光照射下發(fā)生互變異構(gòu)等，從而破壞了平衡濃度與分析濃度之間的正比關系，也就破壞了吸光度A與分析濃度c之間的線性關系，產(chǎn)生對朗伯-比耳定律的偏離。,.,第三節(jié),吸光光度法的儀器,.,第四節(jié),吸光光度法 分析條件的選擇,.,包 括：,(1) 反應條件 (2) 測量條件,.,一、顯色反應及其條件的選擇,(一) 顯色反應和顯色劑 顯色反應：將被測組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔锏姆磻Q為。 顯色劑：能與被測組分反應使之生成有色物質(zhì)的試劑稱為 。,.,1. 顯色反應,顯色反應可分兩大類： (1) 絡合反應 例如：鄰二

19、氮菲與Fe2+絡合使得本來顏色很淺的Fe2+轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色鄰二氮菲亞鐵絡合物。 絡合反應是最主要的顯色反應。 (2) 氧化還原反應 例如：用過硫酸胺將接近無色的Mn2+氧化為紫色的MnO4-。,.,選擇顯色劑和顯色反應的一般標準,一種被測組分究競應該用哪種顯色劑和顯色反應，可根據(jù)所需標準加以選擇。,.,(1) 選擇性要好,一種顯色劑最好只與一種被測組分起顯色反應，這樣干擾就少?；蛘吒蓴_離子容易被消除、或者顯色劑與被測組分和干擾離子生成的有色化合物的吸收峰相隔較遠。,.,(2)靈敏度要高,由于吸光光度法一般是測定微量組分的，靈敏度高的顯色反應有利于微量組分的測定。靈敏度的高低可從摩爾吸光系數(shù)值的大小

20、來判斷，值大靈敏度高，否則靈敏度低。但應注意，靈敏度高的顯色反應，并不一定選擇性就好，對于高含量的組分不一定要選用靈敏度高的顯色反應。,.,(3)對比度要大,即如果顯色劑有顏色，則有色化合物與顯色劑的最大吸收波長的差別要大，一般要求在60nm以上。,.,(4)有色化合物要穩(wěn)定、組成要恒定,有色化合物的組成若不確定，測定的重現(xiàn)性就較差。有色化合物若易受空氣的氧化、日光的照射而分解，就會引入測量誤差。 這樣可以保證測量結(jié)果有良好的重現(xiàn)性和足夠高的準確度，實驗條件也易于控制。,.,(5)顯色反應的條件要易于控制,如果條件要求過于嚴格，難以控制，測定結(jié)果的重現(xiàn)性就差。,.,2. 顯色劑,常用的顯色劑主

21、要有兩大類： (1) 無機顯色劑 (2) 有機顯色劑,.,(1) 無機顯色劑,許多無機試劑能與金屬離子起顯色反應，如Cu2+與氨水形成深藍色的絡離子Cu(NH4)42+，SCN-與Fe3+形成紅色的絡合物Fe(SCN)2+或Fe(SCN)63-等。但是多數(shù)無機顯色劑的靈敏度和選擇性都不高，其中性能較好，目前還有實用價值的有硫氰酸鹽、鉬酸銨、氨水和過氧化氫等。,.,(2) 有機顯色劑,許多有機試劑，在一定條件下，能與金屬離子生成有色的金屬螯合物(具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的絡合物)。 有機顯色劑與金屬離子能形成穩(wěn)定的、具有特征顏色的螯合物，其靈敏度和選擇性較高，是光度分析中研究最多、應用最廣的一類顯色劑。,.

22、,金屬螯合物應用于光度分析的優(yōu)點,1. 大部分金屬螯合物都呈現(xiàn)鮮明的顏色，摩爾吸光系數(shù)大于104，因而測定的靈敏度很高； 2. 金屬螯合物都很穩(wěn)定，一般離解常數(shù)都很小，而且能抗輻射； 3. 專用性強，絕大多數(shù)有機整合劑，在一定條件下，只與少數(shù)或其一種金屬離子絡合，而且同一種有機螯合劑與不同的金屬離子絡合時，生成具有特征顏色的螯合物。,.,4. 雖然大部分金屬螯合物難溶于水，但可被萃取到有機溶劑中，大大發(fā)展了萃取光度法。 5. 在顯色分子中，金屬所占的比率很低，提高了測定的靈敏度。 因此，有機顯色劑是光度分析中應用最多最廣的顯色劑，尋找高選擇性、高靈敏度的有機顯色劑，是光度分析發(fā)展和研究的重要內(nèi)

23、容。,.,有機化合物為什么有顏色，主要由其結(jié)構(gòu)決定，即其結(jié)構(gòu)具有特殊的生色基團和助色基團。,有機顯色劑的結(jié)構(gòu),.,生色團,在有機化合物分子中，凡是包含有共軛雙鍵的基團如NN、NO、NO2、對醌基、CO(羰基)、CS(硫羰基)等，一般都具有顏色，原因是這些基團中的電子被光激發(fā)時，只需要較小的能量，能吸收波長大于200nm的光，因此，稱這些基團為生色團。,.,助色團,某些含有未共用電子對的基團如胺基NH2，RHN，R2N(具有一對未共用電子對)，羥基-OH(具有兩對末共用電子對)，以及鹵代基F，Cl，Br，I等，它們與生色基團上的不飽和鍵互相作用，引起永久性的電荷移動，從而減小了分子的活化能促使試

24、劑對光的最大吸收“紅移” (向長波方向移動)，使試劑顏色加深，這些基團稱為助色團。,.,含有生色基團的有機化合物常常能與許多全屬離子化合生成性質(zhì)穩(wěn)定且具有特征顏色的化合物，且靈敏度和選擇性都很高，這就為用光度法測定這些離子提供了很好的條件。 有機顯色劑的種類很多，常用的有： 1. 鄰二氮菲 2. 雙硫腙 3. 二甲酚橙 4. 偶氮胂III 5. 鉻天青S,常用的有機顯色劑,.,(二) 顯色反應條件的選擇,顯色反應能否完全滿足光度法的要求，除了與顯色劑的性質(zhì)有主要關系外，控制好顯色反應的條件也是十分重要的，如果顯色條件不合適，將會影響分析結(jié)果的準確度。,.,1.顯色劑的用量,顯色就是將被測組分轉(zhuǎn)

25、變成有色化合物。 表示： M + R = MR (被測組分) (顯色劑) (有色化合物) 反應在一定程度上是可逆的。為了減少反應的可逆性，根據(jù)同離子效應，加入過量的顯色劑是必要的，但也不能過量太多，否則會引起副反應，對測定反而不利。 合適的加入量由實驗確定。,.,顯色劑的用量的實驗確定,1. 配置一系列固定了被測組分的濃度和其它條件，只有加入的顯色劑量不同的測試溶液。 2. 測其吸光度。 3. 以吸光度A對顯色劑c作圖。,.,試液吸光度與顯色劑濃度的關系曲線,A隨c的增加而增 大，曲線出現(xiàn)平 臺，這是顯色劑 濃度的選擇范圍。,A隨c的增加而增 大而又下降，曲 線出現(xiàn)最大值， 這是顯色劑濃度 的

26、選擇范圍。,A隨c的增加而不 斷增大，曲線不 出現(xiàn)平臺，這時 必須嚴格控制顯 色劑用量。,.,2.溶液的酸度,溶液酸度對顯色反應的影響很大，這是由于溶液的酸度直接影響著金屬離子和顯色劑的存在形式以及有色絡合物的組成和穩(wěn)定性。因此，控制溶液適宜的酸度，是保證光度分析獲得良好結(jié)果的重要條件之一。,.,(1) 酸度對被測物質(zhì)存在狀態(tài)的影響,大部分高價金屬離子都容易水解，當溶液的酸度降低時，會產(chǎn)生一系列羥基絡離子或多核羥基絡離子。高價金屬離子的水解象多元弱酸的電離一樣，是分級進行的。 隨著水解的進行，同時還發(fā)生各種類型的聚合反應。聚合度隨著時間增大，而最終將導致沉淀的生成。顯然，金屬離子的水解，對于顯

27、色反應的進行是不利的，故溶液的酸度不能太低。,.,(2) 酸度對顯色劑濃度和顏色的影響,光度分析中所用的大部分顯色劑都是有機弱酸。顯色反應進行時，首先是有機弱酸發(fā)生離解，其次才是絡陰離子與金屬離子絡合。 M + HRMR + H+ 從反應式可以看出，溶液的酸度影響著顯色劑的離解,并影響著顯色反應的完全程度。當然，溶液酸度對顯色劑離解程度影響的大小，也與顯色劑的離解常數(shù)有關，Ka大時，允許的酸度可大；Ka很小時，允許的酸度就要小些，故溶液的酸度不能太高。,.,例 如：,許多顯色劑本身就是酸堿指示劑，當溶液酸度改變時，顯色劑本身就有顏色變化。如果顯色劑在某一酸度時，絡合反應和指示劑反應同時發(fā)生，兩

28、種顏色同時存在，就無法進行光度測定。 例如：二甲酚橙在溶液的pH6.3時呈紅色，在pH6.3時呈檸檬黃色，在pH6.3時，呈中間色，故pH6.3時，是它的變色點。而二甲酚橙與金屬離子的絡合物卻呈現(xiàn)紅色。因此，二甲酚橙只有在pH6的酸性溶液中可作為金屬離子的顯色劑。如果在pH6的酸度下進行光度測定，就會引入很大誤差。,.,對于某些逐級形成絡合物的顯色反應、在不同的酸度時，生成不同絡合比的絡合物。例如鐵與水楊酸的絡合反應，當 pH4 Fe3+(C7H4O3)2-+ (1:1) 紫色 4pH9 Fe3+(C7H4O3)22- (1:2) 紅色 pH9 Fe3+(C7H4O3)32-3- (1:3)

29、黃色 在這種情況下，必須控制合適的酸度，才可獲得好的分析結(jié)果。,(3)對絡合物組成和顏色的影響,.,(1) 時間 顯色反應的速度有快有慢。大多數(shù)顯色反應速度較慢，需要一定時間，溶液的顏色才能達到穩(wěn)定程度。有些有色化合物放置一段時間后，由于空氣的氧化，試劑的分解或揮發(fā)，光的照射等原因，使顏色減退。適宜的顯色時間和有色溶液穩(wěn)定程度，也必須通過實驗來確定。實驗方法是配制一份顯色溶液，從加入顯色劑計算時間、每隔幾分鐘測定一次吸光度，繪制A-t曲線，根據(jù)曲線來確定適宜的時間。,3.時間和溫度,.,不同的顯色反應需要不同的溫度，一般顯色反應可在室溫下完成。但是有些顯色反應需要加熱至一定的溫度才能完成；也有

30、些有色絡合物在較高溫度下容易分解。因此，應根據(jù)不同的情況選擇適當?shù)臏囟冗M行顯色。溫度對光的吸收及顏色的深淺也有一定的影響，故標樣和試樣的顯色溫度應保持一樣。合適顯色溫度也必須通過實驗確定,做A-T曲線即可求出。,(2) 溫度,.,4.有機溶劑和表面活性劑,溶劑對顯色反應的影響表現(xiàn)在下列幾方面。,.,(1) 溶劑影響絡合物的離解度,許多有色化合物在水中的離解度大，而在有機溶劑中的離解度小，如在Fe(SCN)3溶液中加入可與水混溶的有機試劑(如丙酮)，由于降低了Fe(SCN)3的離解度而使顏色加深提高了測定的靈酸度。,.,(2) 溶劑改變絡合物顏色,溶劑改變絡合物顏色的原因可能是各種溶劑分子的極性

31、不同、介電常數(shù)不同，從而影響到絡合物的穩(wěn)定性，改變了絡合物分子內(nèi)部的狀態(tài)或者形成不同的溶劑化物的結(jié)果。,.,(3) 溶劑影響顯色反應的速度,例如，當用氯代磺酚S測定Nb時，在水溶液中顯色需幾小時，如果加入丙酮后，僅需30分鐘。,.,表面活性劑的加入可以提高顯色反應的靈敏度，增加有色化合物的穩(wěn)定性。其作用原理一方面是膠束增溶，另一方面是可形成含有表面活性劑的多元絡合物。,表面活性劑的使用,.,共存離子存在時對光度測定的影響有以下幾種類型：,5.共存離子的干擾及消除,.,(1) 與試劑生成有色絡合物,如用硅鉬藍光度法測定鋼中硅時，磷也能與鉬酸銨生成絡合物，同時被還原為鉬藍，使結(jié)果偏高。,.,(2)

32、 干擾離子本身有顏色,如Co2+(紅色)、Cr3+(綠色)、Cu2+(藍色)。,.,(3) 與試劑結(jié)合成無色絡合物,與試劑結(jié)合成無色絡合物消耗大量試劑而使被測離子絡合不完全。 如用水揚酸測Fe3+時，Al3+、Cu2+等有影響。,.,(4) 與被測離子結(jié)合成離解度小的另一化合物,如由于F-的存在，能與Fe3+以FeF63-形式存在，F(xiàn)e(SCN)3本不會生成，因而無法進行測定。,.,(1) 控制酸度 控制顯色溶液的酸度，是消除干擾的簡便而重要的方法。許多顯色劑是有機弱酸，控制溶液的酸度，就可以控制顯色劑R的濃度，這樣就可以使某種金屬離子顯色，使另外一些金屬離子不能生成有色絡合物。 當溶液的情況

33、比較復雜，或各種常數(shù)值不知道時，則溶液最適合的pH值須通過實驗方法來確定。,消除干擾的方法主要有以下三種：,.,在顯色溶液里加一種能與干擾離子反應生成無色絡合物的試劑，也是消除干擾的有效而常用的方法。 例如：用硫氰酸鹽作顯色劑測定Co2+時，F(xiàn)e3+有干擾，可加入氟化物，使Fe3+與F-結(jié)合生成無色而穩(wěn)定的FeF63-，就可以消除干擾。 在另外的情況下，也可通過氧化還原反應，改變干擾離子的價態(tài)以消除于擾。,（2）加入掩蔽劑,.,（3）采用萃取光度法,用適當?shù)挠袡C溶劑萃取有色組分，如用丁二酮肟測定鈀時，鈀與丁二酮肟所形成的內(nèi)絡鹽，可被氯仿從酸性溶液中選擇性地萃取。許多干擾離子則不被萃取。,.,A

34、. 在不同波長下測定兩種顯色配合物的吸光度,對它們進行同時測定。 B. 尋找新的顯色反應 如將二元配合物改變?yōu)槿浜衔铩?C. 分離干擾離子 在沒有適當掩蔽劑時，干擾離于可用電解法，淀法或離子交換法等分離除去。 D. 還可以通過選擇適當?shù)臏y量條件，消除干擾離子的影響。,(4) 其它方法,.,二、吸光光度法的測量誤差及測量條件的選擇,光度分析法的誤差來源有兩方面， (1) 是各種化學因素所引入的誤差， (2) 是儀器精度不夠，測量不準所引入的誤差。,.,1. 儀器測量誤差：是指在測量吸光度或透射比時所產(chǎn)生的誤差。 任何光度計都有一定的測量誤差。,(一) 儀器測量誤差,.,2. 儀器測量誤差的來

35、源,儀器測量誤差的來源是多方面的。 (1) 光源的發(fā)光強度不穩(wěn)定。 (2)光電效應的非線性、電位計的非線性。 (3) 雜散光的影響、濾光片或單色器的質(zhì)量差(譜帶過寬)。 (4)比色皿的透光率不一致，透光率與吸光度的標尺不準等因素。 對給定的光度計來說，透光率或吸光度的讀數(shù)的準確度是儀器精度的主要指標之一，也是衡量測定結(jié)果準確度的重要因素。,.,3.透射比的讀數(shù)對濃度誤差的影響,光度計主要儀器測量誤差是表頭透射比的讀數(shù)誤差。光度計的讀數(shù)標尺上透射比T的刻度是均勻的，故透射比的讀數(shù)誤差T(絕對誤差)與T本身的大小無關，對于一臺給定儀器它基本上是常數(shù)，一般在0.0020.01之間，僅與儀器自身的精度

36、有關。,.,讀數(shù)誤差T(絕對誤差)對c/c的影響,根據(jù)郎伯-比爾定律：,兩邊微分：,將以上兩式相除即得濃度測量的相對誤差：,此式表明由相同的dT(T)引起的dc/c(c/c)是不相同的。,.,圖10-8 |Er| -T關系圖,假定某儀器的dT = 0.005，按上式計算出T值不同時dc/c的絕對值|Er| ，并作出相應的|Er| -T關系曲線。,結(jié)論：當dT 一定，而被測組分分別處于低濃度范圍(T大)和高低濃度范圍(T小)時， c/c均較大，而且曲線有一最低點。,.,光度法的最佳測量范圍,(1) 最佳測量范圍：透射比在15%70% 吸光度在0.150.80范圍內(nèi)。 由dT引起的|Er|較小。

37、(2) 當TlnT達最大值時， |Er|最小。 令,.,選擇適當?shù)臏y量條件，是獲得準確測定結(jié)果的重要途徑。 選擇適合的測量條件，可從下列幾個方面考慮。,（二）測量條件的選擇,.,1. 測量波長的選擇,由于有色物質(zhì)對光有選擇性吸收，為了使測定結(jié)果有較高的靈敏度和準確度，必須選擇溶液最大吸收波長的入射光。 如果有干擾時，則選用靈敏度低一些，但能避兔干擾的入射光，也能獲得比較滿意的測定結(jié)果。,.,吸光度在0.15-0.80時，測量的準確度較高。為此可以從下列幾方面想辦法： (1) 計算而且控制試樣的稱出量，含量高時，少取樣，或稀釋試液；含量低時，可多取樣，或萃取富集。 (2) 如果溶液已顯色，則可通

38、過改變比色皿的厚度來調(diào)節(jié)吸光度大小。,2. 吸光度范圍的控制,.,3. 參比溶液的選擇,參比溶液是用來調(diào)節(jié)儀器工作零點的，若參比溶液選得不適當，則對測量讀數(shù)準確度的影響較大。,.,(1) 純?nèi)軇┛瞻?選 擇 辦 法,當試液、試劑、顯色劑均在測定波長處無吸收時，可用蒸餾水作參比液，稱純?nèi)軇┛瞻住?.,(2) 試液空白,試劑和顯色劑均無色時，而樣品溶液中其他離子有色時，應采用不加顯色劑的試液溶液作參比液。稱試液空白。,.,(3) 試劑空白,試劑和顯色劑均有顏色時，可將一份試液加入適當掩蔽劑，將被測組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，然后把顯色劑、試劑均按操作手續(xù)加入，以此做參比溶液，稱試劑空白。,

39、.,第五節(jié),吸光光度法的應用,.,一、定量分析,(一) 單組分的測定,1.一般方法,A-c 標準曲線法,.,2. 示差分光光度法,當被測組分含量高時，常常偏離朗伯-比耳定律。即使不偏離，由于吸光度太大，也超出了準確讀數(shù)的范圍，就是把分析誤差控制在5%以下，對高含量成分也是不符合要求的。所以，普通分光光度法只適用于微量或痕量組分的測定，而不適合常量組分(25%)。 如果采用示差法，就能克服這一缺點，也能使測定誤差降到0.5以下。,.,(1) 示差分光光度法與普通光度法的主要區(qū)別,所采用的參比溶液不同。 普通：是以c=0的試劑空白為參比。 示差：是以一個濃度比待測試液cx稍低的標準溶液cs為參比。

40、 (調(diào)節(jié)儀器T=100%，A=0)，然后測A。,.,(2) 示差分光光度法的測定原理,據(jù)L-B定律： 在普通：As= - lgTs = bcs Ax= - lgTx = bcx 在示差：測得的是A = Af cxcs，兩式相減得： A = Ax - As = b(cx - cs)= bC 即：用cs作參比調(diào)零(T=100%)，測得cx吸光度是試液與參比溶液的吸光度差值。 由上式可知：兩溶液吸光度之差A與兩溶液濃度之差c成正比。,.,制作A c標準曲線 從中查得c 即可求出其濃度： cx = cs + c,.,3. 提高測量準確度的原理,示差法相對于普通光度法來說，提高測量準確度的原因是擴展了讀數(shù)標尺。,在普通光度法中，以試劑空白為參比，測得透射比分別為： cs Ts=1