1、微生物基因工程,李剛 副教授,教學內(nèi)容,一、PCR引物的設計與實驗操作技巧；二、基因組文庫的建立與篩選；三、定向進化技術在微生物酶制劑研究中 的應用；四、原核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略； 五、真核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略。,一、PCR引物的設計與實驗操作技巧,聚合酶鏈式反應、分子克隆及DNA序列分析這三大類實驗方法幾乎構(gòu)成了現(xiàn)代分子生物學的實驗工作的基礎。而三者中，PCR方法在理論上出現(xiàn)最早，在實踐中應用得最廣泛。,PCR反應的七種基本成份,熱穩(wěn)定DNA聚合酶。 一對特異的引導DNA合成的寡核苷酸引物。 dNTP（混合液：標準PCR反應包含4種等摩爾濃度的脫氧核苷三磷酸，即dATP、dT

2、TP、dCTP和dGTP。 二價陽離子。所有的熱穩(wěn)定DNA聚合酶都要求有游離的二價陽離子，通常是Mg2+用于激活。 一價陽離子。標準PCR緩沖液內(nèi)包含有 50 mmol/L的KCl，它對于擴增大于500 bp的DNA片段是有益的，提高KCl濃度在約70100mmol/L范圍內(nèi)對改善擴增較短的DNA片段產(chǎn)物是有利的。 模板DNA。含有靶序列的模板DNA科研單鏈或雙鏈形式加入PCR混合液中。閉環(huán)DNA模板的擴增效率略低于線性DNA。盡管模板DNA的長短不是PCR擴增的關鍵因素，但當使用高分子量的DNA（10kb）作模板時，如用限制性內(nèi)切酶先行消化（此酶不應切割其中的靶序列），則擴增效果更好。,PC

3、R引物設計的幾條原則：, 引物長度 一般引物長度為18-30堿基就足夠了。特殊情況下（比如Tm值或GC含量不合適）可以進一步延長到50-60 bp長度。但超過60bp的引物長度比較少見。原因一是超過60bp長度的引物比較難以合成，因此合成價格大幅度增加。另外長引物在合成的時候出錯率也顯著增加。 上下游引物的長度應該基本相等，最好相差不要超過3bp。,2. 堿基組成,GC含量應在40到60之間，4種堿基要在引物中分配均勻。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5端加適量的A、T或G、C尾巴。,3. 重復和自身互補序列,不能有大于3bp的重復序列或自身互補序列存在。這種序列可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)

4、，如果這種結(jié)構(gòu)在PCR條件下穩(wěn)定，它會非常有效地阻止寡聚核苷酸和靶DNA之間的復性。,4上下游引物的互補性,一個引物的3端不允許結(jié)合到另一個引物的任何位點上。因為在PCR中引物的濃度往往是比較高，所以即使引物間微弱的互補，都會導致引物間形成雜交，隨后是引物二聚體的形成和擴增。如果引物二聚體在PCR早期形成，它將和DNA聚合酶、引物及核苷酸競爭進而抑制靶DNA的擴增。精心進行引物設計，應用熱啟動PCR或降落PCR或特制的DNA聚合酶（如： AmpliGold，PerkinElmer）都可以避免引物二聚體的形成。當在一個PCR中應用多對引物時，請注意檢查任何一個3末端都不能和其他任何引物互補。,5

5、. 解鏈溫度（Tm）,解鏈溫度（Tm）： 也稱熔化溫度。計算出來的兩個引物的Tm值相差不能大于5 C。擴增產(chǎn)物的Tm值與引物的Tm值相差不能大于10 C。這些特性保證了擴增產(chǎn)物在每個PCR循環(huán)可有效地變性。,為什么要計算引物的解鏈溫度,因為PCR的進行需要確定三個溫度。第一，變性溫度，變性往往是在94C95C進行，這是Taq DNA聚合酶進行30個或30個以上PCR循環(huán)而活力不致受到過多損失時所耐受的最高溫度；第二，退火溫度。也稱復性溫度。復性通常在比理論計算的引物和模板的溶解溫度（Tm值）低35 C的條件下進行。第三，延伸溫度。對Taq DNA聚合酶來說最適溫度一般為72C78C。 其中，變

6、性溫度和延伸溫度對于每個PCR反應來說幾乎都是固定的，唯一不同的就是退火溫度。而退火溫度與引物的解鏈溫度密切相關，因此必須計算出引物的解鏈溫度后才能確定PCR的退火溫度。,解鏈溫度的計算方法,有幾個公式可用來計算寡核苷酸與其靶序列形成的雜合分子的熔解溫度。但沒有一個是盡善盡美的。最常用的兩個如下：1、Wallace規(guī)則：是一個根據(jù)經(jīng)驗確定的簡便的計算公式，可用來計算長為1520個堿基的引物在高離子強度額溶液中（如1M NaCl）形成完全互補配對時的熔解溫度：TmC 2（AT）4（GC）。公式中AT為核苷酸中A和T殘基的數(shù)目，GC為G和C殘基的數(shù)目。2、Tm/C=81.5C+16.6(lg k+

7、)+0.41%(G+C)-(675/n)。該公式能夠合理預測一條長度為1470個核苷酸的引物在小于或等于0.4M的陽離子溶液中的熔解溫度。在公式中，n是寡核苷酸引物的堿基數(shù)。該公式還可用來計算序列和大小都已知的擴增產(chǎn)物的熔解溫度。 現(xiàn)在已有一些軟件（如 Primer Premium 5）可精確計算所設計引物的Tm值。 退火溫度越高, 所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60和94)完成整個擴增循環(huán), 既省時間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成,反應中所需時間主要是為使整個反應體系達到合適的溫度。通常采用的退火溫度和時間為48-68,1-2min

8、。,6. 3末端,3末端的性質(zhì)非常關鍵。如果可能的話，每個引物的3末端堿基應為G或C，不能為A。然而，并不推薦使用3端有NNCG或NNGC序列的引物，因為末端GC堿基高的自由能可以促進發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，還可能產(chǎn)生引物二聚體。,7向引物的5端添加限制性酶切位點，噬菌體啟動子等序列,有用而又不與靶DNA序列互補的序列一般加到引物的5末端。一般來說，這些序列的存在不會顯著地影響寡核苷酸和靶DNA之間的復性。這些附加序列包括噬菌體啟動子和GC夾子。限制性酶切位點是一個特殊情況。因為位于DNA分子5末端的限制性酶切位點的切割效率比較低，所以引物應當超出限制性內(nèi)切酶識別位點至少3個核苷酸。,保護堿基的確定,

9、保護堿基的確定不是隨意的，通常每一種限制性內(nèi)切酶都有自己最佳的保護堿基。每一種限制性內(nèi)切酶與其對應的最佳保護堿基請到NEB公司網(wǎng)站或互聯(lián)網(wǎng)上查詢。,8. 引導位點的設置,根據(jù)實驗的不同目的，引導位點的設置可能會受到突變位點、限制性內(nèi)切酶位點、編碼序列、微衛(wèi)星序列和順式作用元件的影響。當針對cDNA模板設計引物時，正向和反向引物最好結(jié)合到不同外顯子的不同區(qū)域。這些可以很容易地把來源于cDNA的擴增產(chǎn)物和來源于污染的基因組DNA的擴增產(chǎn)物區(qū)分開。,PCR 設計軟件推薦,Primer Premier 5 WDNASIS Oligo7,PCR 高保真酶推薦,PE公司（ABI）ParkenElmer D

10、NA聚合酶， TakaRa公司的PrimeSTAR HS Polymerase， ToYoBo公司的KodPlus Polymerase。,PCR產(chǎn)物的克隆,在許多研究中,需要將PCR產(chǎn)物克隆,以獲得目的DNA片段。此時,所用PCR循環(huán)數(shù)應盡量小,以減少平臺效應或非特異性擴增產(chǎn)物的干擾。通常將PCR產(chǎn)物插入到載體中有下列一些方法。 1. 平末端連接：由于Taq DNA聚合酶往往在PCR產(chǎn)物3端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR產(chǎn)物前,可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶處理補平末端。 2. 在PCR產(chǎn)物克隆載體尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶會在3端加上多余的非模板

11、依賴堿基,而且對A優(yōu)先聚合,所以PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是A.。利用這一特點,可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上dT或ddT,使載體與PCR產(chǎn)物末端互補并進行連接.載體末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯鍵,保證在載體3端只加上一個ddTTP,而其5端所含的磷酸基團可與PCR產(chǎn)物的3端OH連接,連接產(chǎn)物在載體和PCR產(chǎn)物之間的雙鏈上帶兩個切口,這種重組DNA仍可轉(zhuǎn)化合適的受體菌,并在細菌體內(nèi)修復.目前很多公司已開發(fā)出可直接用于克隆PCR產(chǎn)物的帶3-T的T-Vector。 3. 粘性末端連接：利用引物中附加在5端的

12、限制酶位點,直接將PCR產(chǎn)物經(jīng)適當?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端,與載體連接,產(chǎn)生重組DNA.如果下游兩個引物中含有兩個不同的限制酶位點.經(jīng)酶切后可定向克隆到載體中。,PCR反應有哪些關鍵環(huán)節(jié)？,模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量 PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。,模板最容易出現(xiàn)的問題,一、模板含有雜質(zhì)： 模板中含有雜蛋白質(zhì)；模板中含有Taq酶抑制劑；模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚；模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化

13、處理液，其程序亦應固定,不宜隨意更改。 二、模板發(fā)生變異： 如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。通常模板發(fā)生變異的主要原因是模板切膠回收時間過長（一般應控制在1分鐘以內(nèi)）或無意中將模板置于超凈工作臺中滅菌所致。,PCR引物常見的問題,引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，

14、一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏，導致引物變質(zhì)降解失效。引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。,DNA聚合酶的問題,酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。 需注意的是有時PCR失敗是由于忘加了酶。,Mg2+濃度,Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使

15、PCR擴增失敗而不出擴增條帶。 對于一些難以擴增的模板，建議買PCR Buffer中Mg2+ free的PCR試劑，以便自己通過一些預實驗找出PCR反應中最佳的Mg2+濃度。,PCR反應體積,通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。如果不愿重新摸索條件，一個最簡單可行的辦法是按照小體積的條件多做幾管，最后將PCR產(chǎn)物匯集在一起。另外，PCR管有普通管和薄壁管（thin wall PCR tubes ）之分。普通管和薄壁管的熱傳

16、導效率是不同的。,熱蓋與非熱蓋PCR儀,早期的PCR儀均為非熱蓋，因此每個PCR反應管中需要加入無菌石蠟油，以防止溶液的蒸發(fā)。現(xiàn)在的PCR儀大部分都有熱蓋（及頂部加熱器），會阻止溶液的蒸發(fā)，因此PCR反應管中不需加入石蠟油了。,PCR出現(xiàn)假陽性的原因？,假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。出現(xiàn)假陽性的原因主要有： （1）引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。 （2）靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基

17、因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生，這種污染可以通過更換實驗場地來解決，有時也可用巢式PCR方法來減輕或消除。,非特異性擴增帶出現(xiàn)的原因,PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性

18、擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。,非特異性擴增帶出現(xiàn)的對策（一）,其對策有：必要時重新設計引物；減低酶量或調(diào)換另一來源的酶；降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)；適當提高退火溫度或采用二溫度點法(98變性，65左右退火與延伸.如TaKaRa公司的PrimeSTAR HS DNA Polymerase就是采用的二溫度點法)。,非特異性擴增帶出現(xiàn)的對策（二）,采用熱啟

19、動PCR： 把PCR混合物在顯著低于Tm值的溫度下作哪怕短暫的保溫，也可能產(chǎn)生引物二聚體和非特異性配對。熱啟動PCR則可以大大減少這些麻煩。其目標是在第一個循環(huán)中等溫度升到超過反應物的Tm值后才允許反應中的一兩種關鍵成分進入反應。例如在覆蓋有礦物油的小試驗中，所有反應管的一種公共成分（如Taq酶）可以先不加，而到第一個循環(huán)的變性階段溫度超過80 以后再加。 最近有一種熱啟動的方法是在加入Taq DNA聚合酶前先在管中加入其單克隆抗體（Clonetech 公司的Taq Start Antibody，或者ToYoBo公司的Kod Plus DNA聚合酶），在溫度升高到將中和抗體變性失活之前，抗體阻

20、遏聚合酶的活性，防止反應開始。,非特異性擴增帶出現(xiàn)的對策（三）,嵌套式和半嵌套式PCR對于減少或消除不需要的產(chǎn)物同時提高靈敏度經(jīng)常是很成功的。首先在常規(guī)條件下用第一套跨越目的DNA片段的引物擴增，假象產(chǎn)物經(jīng)常會與引物中的一條或兩條配對，但其內(nèi)部卻是無關序列。接著對一部分反應物產(chǎn)物混合物進行新一輪擴增，采用的引物與第一對引物內(nèi)側(cè)的序列配對，在這一輪擴增中只有真正的產(chǎn)物被擴增。這種辦法即使在目的產(chǎn)物開始用EB染色檢測不到而且有假象帶時也常常獲得成功。半嵌套式PCR，只第二條引物在目的片段一端的內(nèi)側(cè)，也同樣有效。在基因步行或企圖進行5或3端RACE時，由于只有一條引物內(nèi)部的序列是已知的，經(jīng)常需要作這種變動。 采用嵌套式PCR方法，第一、二輪擴增在第20個循環(huán)左右終止而不是象通常的在第3035個循環(huán)終止會獲得更好的結(jié)果，這樣做減少了產(chǎn)生不需要的高分子量帶和成片產(chǎn)物的機會。嵌套式PCR極端敏感，在106基因組DNA背景中一個拷貝的病毒基因也能檢測到。,出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶,PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶；減少dNTP的濃度；適當降低Mg2+濃度；增加模板量，減