1、第六章 基因工程菌苗研究的現(xiàn)狀與發(fā)展 （Status and development of gene engineering bacteria vaccine） 第一節(jié) 概述（Section I outline） 1883年-1885年巴斯德（Pasteur）用理化和生物學方法制備了減毒的炭疽菌苗和狂犬疫苗等。 19世紀以來用菌苗免疫人畜，明顯減少了傳染病的發(fā)生。其中比較成功的是破傷風、白喉類毒素疫苗的應用，其效果可達95%以上。在發(fā)達國家破傷風、白喉、百日咳、嗜血性流感的發(fā)病率明顯降低?？咕幬锏陌l(fā)明和應用，使臨床常見的細菌性感染和病死率大幅下降。,細菌一旦獲得耐藥性，存在與細菌染色體、質粒

2、和轉座子中的耐藥基因就可通過轉化、轉導、接合和轉座等方式，將抗性基因傳播到其他敏感菌，使之成為抗藥菌株，給臨床傳染病的治療帶來困難。據WHO1996年報告，全球每年死亡約5190萬人，其中1/3約1730萬死于傳染病。,在過去20年中，有29種新傳染病出現(xiàn)。美國Satcher博士在Emerging Infectious Diseases雜志創(chuàng)刊刊號列出自1973年以來鑒定的主要傳染病或病原體22種。近年鑒定的新病原體和疾病鑒定年份依次列于表6-1。,表6-1 新鑒定的病原體,新病原體不斷出現(xiàn)與鑒定，新的疫苗研制也相繼開始。 重要病原體全基因測序的開展和完成，及類似生物表型的不同菌屬間的同源序列

3、和異源序列的發(fā)現(xiàn)，對抗感染研究來說，像進行了一場革命，不僅會促進病原體致病和發(fā)病機制的研究，也會開闊和調整菌苗研究的策略和思路。 目前已完成500余種病毒的全基因測序，關于重要病原菌全基因測序進展情況列于表6-2。,表6-2 人類重要病原菌全基因測序現(xiàn)狀,總之，已控制傳染病的再現(xiàn)及新傳染病的出現(xiàn)，已引起全球的注意，對傳染病威脅需要再認識，已有共識。因此，有必要加快進行創(chuàng)新性的細菌菌苗的研制與開發(fā)。,第二節(jié) 目前應用的菌苗及其存在問題 Present bacteria vaccine and the question 一、目前應用菌苗的類別The type of bacteria vaccine

4、 按菌苗所含的成份，菌苗可分為九類，即減毒的活菌苗、滅活的死菌苗、純化的多糖或蛋白成份苗、基因缺失活菌苗、載體重組活菌苗、核酸菌苗、聯(lián)合重組菌苗、多價菌苗、多糖與蛋白結合菌苗。,1、減毒的活菌苗（Attenuated bacteria vaccine） 如卡介苗（BCG），是巴斯德研究院Calmette和Guerin等（1921）將一株牛型強毒結核菌在甘油-膽汁-馬鈴薯培養(yǎng)基上傳230代后（13年），獲得的對動物不致病，但產生抗結核免疫反應的菌苗即BCG。對免疫嬰幼兒有保護效果。 后來發(fā)現(xiàn)對成人的保護效果波動范圍很大，對其減毒機制始終不清。直至近年來完成結核分枝桿菌全基因測序后，與有毒牛型結核

5、分枝桿菌全基因序列進行比較，方知BCG缺失了毒力相關基因。 總之，對胞內菌目前還是用減毒的活菌苗。,2、滅活菌苗 （Dead bacteria vaccine） 通過加熱處理或福爾馬林（formaldehyde）、戊二醛（glutaraldehyde）、-內酯（-propiolactone）等化學處理得到。如霍亂死菌苗、百日咳（Bordetella pertussis）死菌苗等。 死菌苗的主要優(yōu)點是穩(wěn)定，缺點是需要多次免疫才能得到好的保護效果。,3、亞單位或成分苗 （Subunit bacteria vaccine） 從細菌培養(yǎng)液中提取、用化學方法脫毒的類毒素苗，如破傷風類毒素（TT）、白喉類

6、毒素（DT），免疫后誘導機體產生的抗血清能特異中和TT破傷風類毒素或DT白喉類毒素，其保護效果可達95%以上。由于毒素純化方法的改進，產品的副作用很小。,莢膜細菌純化的多糖菌苗，可誘導產生的抗體能保護機體抵抗入侵莢膜菌的感染。如嗜血性流感桿菌b（Hib）、傷寒桿菌Vi多糖等多糖苗，能誘導機體產生T細胞非依賴的抗體反應，其特點是誘導產生短期的IgM抗體，缺乏免疫記憶，對不到18個月幼兒的多糖苗免疫原性差，而沒有保護效果。因此多糖類的菌苗急需改進。,目前，將多糖與載體蛋白共價連接，通過載體蛋白提供適當的T細胞表位，由T細胞協(xié)助B細胞產生多糖特異性抗體，使T細胞非依賴性抗原轉變?yōu)門細胞依賴抗原，這類

7、菌苗稱為多糖-蛋白結合苗。如嗜血流感桿菌Hib的結合苗已在幾個國家獲得證書，證明對不到18個月的兒童有很高的免疫原性，能誘導免疫記憶，免疫球蛋白的類型轉換及抗體親和力成熟，明顯減少Hib菌的入侵感染與發(fā)病。,表6-3 目前可用于人群的菌苗,注：i.d皮內，s.c皮下，d.s劃痕，i.m肌注，p.o口服,（二）研制菌苗的新方法（New method of produce bacteria vaccine） 1、研制菌苗的新方法（new methods） 對細菌感染發(fā)病機制認識的深入及涉及許多病原體毒力決定簇如粘附素、侵襲素、莢膜多糖、脂多糖、毒素等編碼基因及其產物的結構與功能的分析與鑒定，是不斷

8、設計和研制新型疫苗的重要基礎。 針對不同病原體致病特點和毒力決定簇的特點，發(fā)展和產生了不同的菌苗研制方法，得到不同類型的菌苗。 目前研制菌苗新方法及可能的后選菌苗列于表6-4 。,表6-4 目前研制菌苗的新方法及可能的候選菌苗,2、目前菌苗存在的問題（questions） （1）盡管疫苗免疫取得了巨大的成功，但小于5歲的嬰幼兒每年死于傳染病的數目仍然很高。如瘧疾幾種腹瀉病等均無有效疫苗，雖然卡介苗（BCG）使用幾十年了，甚至納入WHO的計劃免疫，但其效果波動很大0%80%，因此急需安全有效的結核菌苗問世。,（2）與病毒相比： 基因工程細菌及細菌核酸苗報導明顯少。至今國際上還沒有成功滿意的重組細

9、菌苗提供人群使用。關于細菌毒素的分子及其編碼基因與調控機制都比較清楚，因此，有關毒素的基因工程菌苗的構建或載體構建等均無問題。 但菌外膜上的其它結構如粘附分子，侵襲蛋白，鞭毛及脂多糖等分子結構十分復雜，編碼基因多呈叢分布，如LPS的表達涉及近30個基因的級聯(lián)反應，操作起來尚有困難。因此還有毒力相關或保護相關基因的分離、克隆和表達等基因工程菌苗研制的前期工作要做,（三）理想菌苗的條件（Ideal bacteria vaccines condition） 理想疫苗應該是： （1）安全，遺傳性狀穩(wěn)定，無毒性，無致癌性，無致畸變或致流產性。 （2）結構簡單清楚，可生物降解，有生物相容性，與組織抗原無免

10、疫學交叉反應。,（3）對各年齡組人群均有長時間的免疫保護作用。 （4）多價，有更大的覆蓋面，最好一次性免疫。 （5）能口服，能有效誘導粘膜免疫。 （6）易于生產，儲存及服務，不需冷藏。 每一項要求，都需要大量的基礎研究，已能提出更為合理的疫苗研究策略，研制出安全高效，使用方便，價格低廉的菌苗,第三節(jié) 重要細菌基因工程苗的研究進展 （Development of important gene engineering bacteria vaccine),當前國內外細菌基因工程菌苗，現(xiàn)有菌苗對重要細菌感染性疾病的問題有： 現(xiàn)有菌苗保護效果不好； 副反應大； 難以培養(yǎng)的細菌； 可誘發(fā)癌變，有嚴重后遺癥

11、； 新出現(xiàn)的病原體或新變異病原菌。,一、霍亂菌苗 (Cholera vaccine) 霍亂是由革蘭氏陰性霍亂弧菌引起的烈性傳染病。 霍亂弧菌在小腸分泌霍亂毒素（CT）引起腹瀉及其他癥狀。 已知有O抗原，毒素共調節(jié)菌毛（TCP），血凝素（HA），外膜蛋白（OMPs）等，及引起水樣腹瀉的霍亂毒素（CT）由AB5的六聚體構成。 霍亂產毒株ctxAB的5端有一6kb的DNA，依次有20t,ace,orfu,cep和RS序列與ctxAB一起稱為霍亂毒素元件（CTX）元件，可進行轉移，與一種絲狀噬菌體（CTX）有關，而非產毒株沒有這段DNA 。,據菌體抗原霍亂弧菌可分為200個以上的血清型 1881-18

12、96年間的5次及1899-1923年的第6次大流行均由O1群古典型霍亂弧菌引起。 第7次大流行自1961年延續(xù)至今，波及五大洲 1992年出現(xiàn)了一新的流行株O139血清型霍亂 目前流行的霍亂為O1和O139兩種血清型。 近十年來研制的新霍亂菌苗有四類：,1.BS/WC滅活菌苗(BS/WC dead bacteria vaccine ） 由提取的或重組的霍亂毒素B亞單位（BS）及殺死的全菌細胞（WC）組成。 2.CVD103-HgR減毒活菌苗（Levine 1998） 在美國獲準，為一次劑量的霍亂活菌苗。它是由霍亂經典型569B菌株構建而成的CVD103減毒株（CTA-B+）。并在其染色體溶血素

13、基因nlyA位點插入汞抗性基因作為篩選標記。 3.以沙門氏菌為載體表達霍亂弧菌O抗原的傷寒/霍亂雙價菌苗。 4.O139減毒菌苗候選株CVD112及Bengal-15,表6-5 重組霍亂菌苗的特性,a副反應包括由疫苗株引起的腹瀉，腹部痙攣，厭食，發(fā)熱 b服苗者糞便中排菌苗株的百分率 c用野生株攻擊服苗者不發(fā)生腹瀉的百分率 d攻擊后在服苗者糞便培養(yǎng)中可查到野生型霍亂弧菌的百分率 e未得到數據 f未做,另外，發(fā)現(xiàn)霍亂毒素是很強的黏膜免疫原，能有效刺激黏膜sIgA及血清IgG反應，及黏膜免疫記憶反應，對CT及CTB的免疫佐劑活性進行了大量的研究，對多種蛋白、多糖及病毒、細菌等的免疫佐劑效果得到肯定的

14、認識。進展情況見表6-6。,表6-6 CT/CT-B佐劑應用的抗原,二、痢疾菌苗（Dysentery vaccine） 痢疾是我國常見和多發(fā)傳染病，其發(fā)病率始終居24種法定傳染病的前二位。 主要病原體為痢疾桿菌，其致病特點是定居侵入結腸黏膜上皮細胞，且能迅速溶解吞噬泡膜進入胞漿. 臨床表現(xiàn)為發(fā)燒，膿血便，腹瀉，里急后重，甚至引起神經癥狀和血尿綜合癥。,痢疾菌共有4群：A志賀氏痢疾菌（Shigella dysenteriae），B福氏痢疾菌（S.flexneri），C鮑氏痢疾菌（S.bordii）和D宋內氏痢疾菌（S.sonnei）。 按其菌膜表面LPS-O抗原分為44個血清型。 目前已知至少2

15、7個基因和15個蛋白與痢疾菌入侵宿主細胞相關，它們作為III型分泌系統(tǒng)的調節(jié)子與效應子，以接觸依賴方式被分泌進入宿主細胞。,1.死菌苗（Dead bacteria vaccine） 五、六十年代大量動物及人體實驗證明滅活的痢疾全菌非口服途徑，雖可誘導機體產生高的血清抗體，但沒有保護效果； 用提取的宋氏痢疾菌的核糖體，皮下免疫途徑，在豚鼠和猴中證實可提供特異保護，證明LPS-O多糖是保護性抗原； Robbins(1992)將痢疾菌LPS與不同蛋白載體（TT，DT）交聯(lián)進行非口服途徑免疫能誘導豚鼠產生高的血清抗體反應，豚鼠眼模型證明有一定保護作用。 宋內氏LPS-O-蛋白（TT，DT）有保護作用，

16、Robbins（1996）將多糖-蛋白結合苗用于越南士兵，報告宋氏多糖-蛋白結合苗保護效果達70%。,2.活菌苗（Living bacteria vaccine） 采取了多種方法進行痢疾菌野生毒株的減毒研究。 Meitert等（1984）在膽鹽平皿連續(xù)傳代32次獲得S.f2a減毒株IstratiT32； 80年代初中國近一萬人現(xiàn)場觀察，證實T32菌苗安全，有保護活性，效果與免疫次數和劑量有關。,80年代中國國內以T32為受體株開始致力于構建雙價痢疾菌苗株的研究。 牟兆欽等，1989年將一編碼宋內氏菌LPS-O抗原的大質粒轉移至T32菌中獲得福氏2a宋內氏雙價痢疾菌苗株FS-18，F(xiàn)SM2117

17、；宋樹珍等構建了FS痢疾雙價菌苗株，其中FSM2117識別福氏2a和識別宋內氏痢疾苗LPS-O抗原； 林紀勝(1999)構建了S.flexenri 2a和S.dysenteria I雙價痢疾菌株，有雙價免疫原性，現(xiàn)FSM2117與FS兩株痢疾雙價菌苗均已獲國家新生物制品證書和試生產文號。,90年代國內外開展了痢疾侵襲活菌苗的研究。主要針對痢疾菌毒力相關基因的插入失活或缺失的方法，構建減毒突變株，目的是保存其入侵能力，限制其無限繁殖能力。對其免疫原性和保護效果進行了大量實驗室研究。 國外工作主要集中在福氏2a，福氏5型或Y型。構建出福氏2a-宋內氏雙價侵襲的菌苗株，目的是降低目前非侵襲雙價苗的免

18、疫劑量，提高免疫原性。,痢疾桿菌III型分泌系統(tǒng)將不同侵襲蛋白分泌和導入宿主細胞的調節(jié)分子與效應分子的鑒定，可能會找到構建痢疾基因工程菌苗新的靶分子和靶基因。,表6-7 入侵性痢疾基因工程菌苗候選株研制情況,注：a胞內擴散；b國內研制；c,gp豚鼠；d,m猴；e,h人,三、產毒性大腸桿菌苗（ETEC vaccine） ETEC是嬰幼兒和旅游者腹瀉的主要病原菌。 全球年病例為2.1億次，死亡病例達38萬，多為5歲以下的兒童。 其致病特征是分泌ST和LT毒素及菌膜表面存在致病相關的菌毛抗原CFAs。正在采用減毒痢疾菌為載體進行LT或菌毛抗原的表達，進行多價菌苗研制的前期工作，或用重組的BCG為載體

19、進行LT-B的表達研究。國內早年構建表達K88、K99及LT的幼畜工程菌苗已投入生產。,四、 腸出血性大腸桿菌苗（EHEC苗） 大腸桿菌O157：H7是腸出血性大腸桿菌的主要病原菌，首次鑒定于1982年。1996年日本大規(guī)模爆發(fā)EHEC O157出血性腸炎以來，引起國際上的極大關注。 致病特點通過特殊的黏附分子（intimin）黏附靶器官，產生類志賀毒素和腸溶血素（hly）等，出血性腹瀉，溶血性尿毒綜合癥，血栓形成性血小板減少性紫癜。,當前研制的菌苗O157多糖綠膿桿菌外毒素蛋白的結合苗（O157LPS-rEPA），已進行I期臨床觀察，認為安全，有免疫原性。重組的Stx的減毒活菌苗，重組Stx

20、亞單位苗及鈷照射的全菌死菌苗正在進行動物實驗觀察。,五、傷寒桿菌（Typhoid bacillus vaccine） 傷寒桿菌能入侵腸黏膜上皮細胞，在吞噬細胞酸性吞噬泡內存活，經淋巴系統(tǒng)進入血流引起菌血癥，近而侵犯肝，脾，腎等多種臟器與器官，并大量繁殖而再次引起嚴重菌血癥，臨床表現(xiàn)為高熱，胃腸炎，敗血癥等。 世界傷寒桿菌感染病例約300萬，死亡人數50萬。滅活死菌苗已有70余年的歷史，由于副反應較大的問題促進了活苗的研制。,Ty21a 是Germamier經NTG誘導后，篩選得到傷寒Vigal E減毒株。它缺乏UDP-4-半乳糖異構酶而不能正常合成胞壁脂多糖，在體內外有半乳糖供給情況下可正常合

21、成細胞壁。 傷寒Vi多糖苗 Vi是位于菌膜LPS外的莢膜多糖抗原，由O-乙酰-氨基糖醛酸高度聚合而成，可阻止外膜與補體的結合，對菌的入侵也有一定作用。目前正進行Vi多糖與蛋白交聯(lián)的結合苗的研制。 另外，國內外用減毒的傷寒桿菌或鼠傷寒桿菌作為載體表達外源抗原進行多價菌苗研究的探索 。,六 、結核菌苗（Tubercle vaccine） 據WHO估計，全球每年增加結核病人達800萬，年死亡病例為300萬。 全球有1/3的人（即17億）曾感染過結核，其中90%-95%的人感染初期并無癥狀，此時雖然機體的免疫反應控制了初始的感染，但并未完全排除病原體。,最近的研究進展證明T細胞不僅只分泌TH1類的細胞

22、因子激活感染的宿主細胞殺傷病原體，而且通過CTL溶解感染靶細胞和胞內病原體，CD8+T細胞在直接殺傷胞內結核桿菌有其特殊作用。 結核桿菌是專性需氧胞內致病菌，由于血清各種檢測方法交叉反應嚴重，至今不甚清楚它的抗原決定簇的定位及數目，其毒力機制不清。,卡介苗（BCG）是預防結核病的唯一活菌苗，經大量資料的統(tǒng)計指出BCG的效果波動很大（0%-80%）。以及在艾滋病人和HIV攜帶者接種BCG后發(fā)生全身性感染，促使人們研制新一代結核菌苗。顯然核酸免疫是結核菌苗的重要研究方向。,由于BCG廣泛應用的安全性，它可長期在體內存活，其增殖可達幾個月，生長緩慢可誘發(fā)強的，持續(xù)的免疫應答，具有佐劑活性，可誘發(fā)TH

23、1型免疫反應，以BCG為載體構建重組疫苗的研究日益受到注意。,七、 嗜血流感桿菌苗（Hib） 嗜血流感桿菌（Hib）為G-有莢膜短小桿菌，其莢膜多糖有特異型免疫原性，其中b型毒力最強，主要引起化膿性感染如急性肺炎、腦膜炎、敗血癥等，常在流感、麻疹、百日咳、肺結核等之后合并感染。,磷酸聚核糖基核糖醇（PRP）是Hib多糖菌苗的有效成分，將PRP與載體蛋白如白喉（DT）、破傷風類毒素（TT）腦膜炎球菌外膜蛋白（OMP）等共價交聯(lián)成多糖-蛋白結合苗。證明Hib-蛋白結合苗對嬰幼兒使用安全，有免疫原性，可誘導免疫記憶，入侵性Hib嗜血流感桿菌感染有防御作用。,由于Hib結合苗的成功，WHO對目前批準的

24、23個血清型肺炎球菌多糖與蛋白交聯(lián)的結合苗，在各地進行臨床觀察，其中美國已完成III期臨床，認為高度有效，用結合苗控制肺炎球菌病很可能會獲更大成功。,八、 細菌的DNA苗 DNA菌苗是用編碼抗原基因的真核表達質粒DNA直接于體內接種后，被細胞攝取并轉錄翻譯，表達相應的抗原，通過不同途徑誘導機體的特異免疫應答。進展情況列于表6-8。,表6-8 細菌DNA免疫研究情況,在核酸免疫研究中，用減毒的胞內細菌釋放DNA苗的報導引人注意。 絕大多數的胞內菌都可被DNA轉染，攜帶這些質粒進入細胞的吞噬泡或胞漿，釋放DNA；表達編碼抗原，誘導體液或細胞免疫。 與裸DNA釋放相比，用細菌釋放DNA的優(yōu)點 如下：

25、,1）用肌肉注射或基因槍注入DNA只能轉染有限的抗原提呈細胞（APCs）；而通過適當的細菌釋放DNA，能將質粒DNA特異靶向相關免疫組織的APCs，且除APCs外，還可靶向樹突狀細胞（DCs），能更好地進行抗原提呈。 2）細菌的成份，如G-菌的LPS和G+菌的脂肽酸及細菌DNA中沒有甲基化的序列等，都有佐劑活性，可增加釋放DNA的免疫原性。 3）細菌載體還能進行口服，轉染腸相關淋巴組織，促進粘膜免疫效果。他們可停留在吞噬泡中，也可通過分泌溶質膜素破泡而進入胞漿?？刂瓶乖岢实耐緩郊跋鄳腡細胞亞類的效應反應。,用胞內細菌釋放DNA系統(tǒng)也存在危險因素： 1）入侵性雖然利于DNA釋放，也存在毒力回復的危