1、植物源性重組人血清轉鐵蛋白的多功能性概述人血清轉鐵蛋白（htf）是人血清中主要的結合鐵蛋白質(zhì)，在鐵轉運中有重要作用。另外，htf還有許多其他的作用，包括抗菌功能和對哺乳動物細胞增殖、分化中的生長因子效用。其多功能性使其在不同療法和商業(yè)應用中有巨大價值。然而，htf的這些成功應用很大程度上取決于大量的高質(zhì)量的htf的應用。本研究中，我們將植物作為獲得重組htf的一種新平臺。我們的研究表明轉基因植物是一種獲得rhtf的有效系統(tǒng)，最大積累量達到了全部可溶蛋白的0.25%（或高達33.5ug/g的葉子鮮重）。此外，植物源性rhtf保持了許多與天然htf相同的生物活性。尤其是rhtf在體外可逆性的結合鐵

2、作用，表明了其抑菌活性、在無血清培養(yǎng)基中的支持細胞增值的作用，和在體外內(nèi)化進入哺乳動物細胞的性質(zhì)。本研究的成功使得未來多領域應用植物源性rhtf成為可能。植物源性rhtf突出的應用就是作為特定細胞的一種新的載體或者作為蛋白質(zhì)/肽段藥物的口服遞送以治療人類疾病例如糖尿病。為證明此假說，我們在植物中又額外地表達了一種包含胰高血糖素樣肽段-1（GLP-1）或其衍生物的htf融合蛋白。在此，我們展示植物源性htf-GLP-1融合蛋白保持了體外培養(yǎng)基中內(nèi)化進入哺乳動物細胞的能力。簡介轉鐵蛋白Tf包含了所有脊椎動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一系列同源性的鐵結合蛋白糖蛋白（Aisen and Harris, 1989），主

3、要功能是鐵的螯合和轉運。Tf是一種單分子蛋白，分子量范圍為76-81 kDa，取決于糖基化程度。每種TF蛋白包含兩種相似的裂片，分別叫做N-末端和C-末端，每一裂片包含單一的鐵結合位點（Aisen and Harris, 1989; Baker et al., 2002）。hTf是轉鐵蛋白Tf家族的主要成員。hTf蛋白由679個氨基酸組成，主要在肝臟合成并分泌入血（MacGillivray et al., 1983）。hTf的主要功能是絡合血中的游離鐵并將之轉運到全身各處（MacGillivray et al., 1983）。放射示蹤研究顯示至少80%的絡合至tHf的鐵轉運至骨髓并組成新生的紅

4、細胞（Finch and Huebers, 1982）。除其眾所周知的鐵轉運功能外，hTf還有許多額外的功能，許多與其攜鐵能力無關。例如，研究顯示HTF可促進體外無血清培養(yǎng)基條件下鼠粒性白細胞和巨噬細胞前體細胞的克隆生長（Iizuka and Murphy, 1986）。另外，HTF的存在對于大多數(shù)哺乳動物細胞的培養(yǎng)有重要作用，例如體外受精培養(yǎng)（Holst et al., 1990）和肝細胞群體的維護和擴展（Suzuki et al., 2006）。當增殖細胞高表達HTF受體以允許HTF包裹并可能引發(fā)和維持細胞DNA合成時，HTF常常作為一種生長因子（Gomme et al., 2005）。H

5、TF的其他作用包括抵抗細菌、酵母菌、病毒和真菌的抗菌活性（(Artis et al., 1983; Salamah and al-Obaidi, 1995），降低細胞粘附的能力（Ardehali et al.,2002）。HTF的多功能性可以作為潛在的治療和非治療應用。例如，HTf已被用來治療人類轉鐵蛋白缺乏癥（一種以貧血、鐵超載、生長遲緩和感染發(fā)生率增加為特點的狀況）（Hayashi et al., 1993），局部貧血-再灌注損傷（促進氧化應激導致炎癥、最終因凋亡和壞死而導致細胞死亡的一種情況）（Hayashi et al., 1993）和心血管疾?。℉ayashi et al., 199

6、3）。HTF的治療送遞也降低了放射療法的副作用（Koterov et al., 2003），有助于為骨髓移植患者提供抗微生物活性的作用（von Bonsdorff et al., 2003）。此外，HTF已用來作為一種新的載體系統(tǒng)，在體內(nèi)運載藥物入癌細胞（Laske et al., 1997）。近來，HTF被證實作為一種高效的載體，以送服口服蛋白質(zhì)和氨基酸藥物入內(nèi)臟以實現(xiàn)全身治療效果（Widera et al.,2004; Bai et al., 2005）。HTF蛋白也有許多巨大的潛在非治療應用。例如，許多無血清培養(yǎng)基以HTF作為血清代用品，支持哺乳動物細胞生長（Barnes and Sat

7、o, 1980a,b）。為了使HTF的這些商業(yè)和治療應用具備可行性和得到實現(xiàn)，大量HTF的可靠、廉價的供應是很重要的，取決于一種高效、性價比合算的重組生產(chǎn)系統(tǒng)。迄今為止，已有數(shù)種表達系統(tǒng)報道獲得重組HTF。描述的RHTF的細菌表達，僅允許生產(chǎn)蛋白質(zhì)的氨基末端和羧基末端領域（半分子）（Ikeda et al., 1992; Steinlein and Ikeda, 1993;de Smit et al., 1995），隨著19HTF分子內(nèi)二硫鍵的出現(xiàn)，使得利用微生物主機獲得這種蛋白成為了一項挑戰(zhàn)。使用細菌獲得重組的進一步限制，是其從重組蛋白到獲得功能性產(chǎn)品過程中無法去除信號肽（MacGilliv

8、rayet al., 1998）。作為一個可選擇的細菌生產(chǎn)系統(tǒng)，已證實rhTf在幼倉鼠腎（）細胞的表達（Funk et al., 1990; Masonet al., 1991, 1993, 2001）。雖然成功了，但幼倉鼠腎細胞系統(tǒng)受限于低產(chǎn)量的rhTf（no more than 40 mg Lof cell culture）。為了降低生產(chǎn)難度，已研究了數(shù)個表達系統(tǒng)，包括酵母菌（僅在的末端領域和兩個突變類型表達）（Steinlein et al., 1995;Sargent et al., 2006）、使用桿狀病毒表達系統(tǒng)的昆蟲細胞（ 20毫克L的細胞培養(yǎng)）（Ali et al.,1996）

9、和果蠅細胞（不超過0.35毫克L的細胞培養(yǎng)）（Lim et al., 2004）。因為這些系統(tǒng)都是依靠昂貴的細胞培養(yǎng)和發(fā)酵方法，他們不適合低成本的規(guī)模化生產(chǎn)。此外，哺乳動物的細胞培養(yǎng)很容易受到細菌和病毒病原的污染，導致產(chǎn)品安全的擔憂。植物生物反應器已被證實作為一種有效的、有吸引力的重組哺乳動物蛋白的生產(chǎn)平臺（Schillberg et al., 2005; Daniell, 2006;Boehm, 2007）。作為生物反應器，植物允許無限的可擴展性，通過哺乳動物病原體消除產(chǎn)品污染，以及與微生物或動物相比，使用細胞培養(yǎng)系統(tǒng)降低了生產(chǎn)成本（Daniell,2006; Boehm, 2007; Ma

10、 et al., 2008）。因為他們的真核特性，植物可以進行復雜的轉譯后修改和加工，這是許多轉基因哺乳動物具有治療作用的蛋白質(zhì)的生物學和或免疫學功能所要求的。此外，可食用的轉基因植物組織提供了允許植物源性治療蛋白質(zhì)和多肽直接口服遞送的可能性，消除了昂貴的下游蛋白純化和加工。在本研究中,我們已經(jīng)證實了利用轉基因植物作為生產(chǎn)rhTf新體系的可行性。因為天然hTf是一種分泌分子，rhTf是針對轉基因植物內(nèi)膜系統(tǒng)以提高積累的。在此，我們證明了轉基因煙草植物是一個有效的生產(chǎn)rhTf表達系統(tǒng)，最大限度積累可達0.25%的全部可溶性蛋白質(zhì)（）（或者高達33.5鮮葉組織）。轉基因蛋白質(zhì)的生化和功能特性表明了

11、植物源性是非糖基化的，正如酶和化學去糖基化分析證實的，保留的多項與天然hTf性能相同的性能。尤其是，植物源性rhTf在體外可逆性地絡合鐵，證實了抑菌活性，在無血清培養(yǎng)中支持細胞生長和增殖，并保留了在體外內(nèi)化進入哺乳動物細胞的能力。這些結果表明，植物源性rhTf可能存在許多潛在應用價值。最重要的功能是，使用rhTf作為特定細胞或口服遞送的蛋白質(zhì)和多肽藥物的新載體分子。為了驗證這個假說，我們在轉基因植物中額外引入了一個rhTf融合蛋白，包含抗胰高血糖素樣肽1 (GLP-1)或其衍生物。已證明，當加入到體外細胞培養(yǎng)基，植物源性rhTf-GLP-1融合蛋白有內(nèi)化進入哺乳動物細胞的能力。該研究結果具有重

12、要的影響，其中包括開發(fā)植物源性rhTf作為一種新的靶向給藥系統(tǒng)的可能性，以及未來開發(fā)出基于新的植物源性rhTf治療廣譜疾病方法的可能性。結果轉基因植物的植物表達載體的構建和產(chǎn)生二進制植物表達載體的產(chǎn)生，強本構CaMV 35S促進劑促進了hTf的表達天然信號肽如圖1表明。來源于煙草蝕刻病毒（）的端輸出序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（）保留信號主題整合入以最大限度積累（(Ma et al., 2005; Wang et al., 2008）。即時插入上游信號KDEL的6xHis標簽整合到上，以通過固定化金屬親和層析促進下游的純化（）。低生物堿煙草變種（Menassaet al., 2001）是利用含有pRJC-hT

13、F的根癌農(nóng)桿菌轉變的。所產(chǎn)生的20多個獨立的轉基因煙草株，與所有轉基因植物，表現(xiàn)出了正常的生長和發(fā)育，與非轉變煙草cv. 81V9相比沒有表型方差。hTf整合入核基因組，且其在轉錄水平的表達，分別經(jīng)聚合酶鏈反應（）和逆轉錄聚合酶鏈反應（）而得到證實（數(shù)據(jù)未顯示）。轉基因植物的rhTf蛋白質(zhì)積累rhTf在轉基因植物的積累，通過及其后的使用市面可得的抗hTf抗體的免疫蛋白印跡得到印證。總蛋白萃取物時從植物獲得的，通過獲得rhTf陽性表達。如圖，抗抗體檢測到一個明顯的分子質(zhì)量76的單一蛋白，與標準等同尺寸（Sigma-Aldrich）。不出所料，在相同的條件下的野生植物葉子提取物中沒有檢測到蛋白質(zhì)帶

14、。煙葉提取物中rhTf的相對積累量的測定，采用間接的抗hTf抗體ELISA法與一個hTf標準比較。rhTf的積累水平，發(fā)現(xiàn)在獨立主要轉基因植物(T0plants)，范圍從0.07%到0.25%（或6至33.5鮮葉重）。此外，轉基因煙草植物的rhTf有明顯的空間分布的差異，最上面的葉子表現(xiàn)出最高水平轉基因蛋白質(zhì)積累（數(shù)據(jù)未顯示）。植物源性是非糖基化的為了研究植物源性rhTf的醣化作用，重組蛋白進行了酶、化學去糖基化。對酶的去糖基化，總蛋白提取物以及通過His-purification 得到的植物源性rhTf的部分純化樣品，用PNGase F處理并通過使用抗hTf抗體的免疫印跡法分析。在PNGas

15、e F處理之前，純化rhTf的完整性，通過Coomassie bule stainong考馬斯亮藍染色在SDS - PAGE上確認。hTf蛋白包含兩個可能的糖基化位點羧基末端區(qū)域（Asn413 and Asn611）（Spik et al., 1975）。用PNGase F對糖基化hTf標準（Sigma-Aldrich）的消化作為陽性對照。PNGase F能夠去除高甘露醇和復雜類型N-聚糖，除了含有a-(1,3)-linked的核心海藻糖，一般在植物糖蛋白中發(fā)現(xiàn)（Lerouge et al.,1998）。如圖3示：與未經(jīng)處理的對照樣品相比，在經(jīng)PNGase F處理的總蛋白提取物或部分凈化的rh

16、Tf樣品中沒有看到可察覺到的漂移帶。相反，在相同條件下，商業(yè)糖化hTf標準和PNGaseF的消化，降低了其分子量至大約73kDa的單帶，這正是期待的hTf的非糖基化成分。與酶去糖基化得到的結果一致，使用三氟甲磺酸His-purified的植物源性rhTF的化學去糖基化，這非特定地移除所有伴隨蛋白質(zhì)的碳水化合物，導致rhTf的移動性沒有變化（圖3b）。加在一起，這些結果表明植物源性rhTf是非糖基化的。非糖基化的植物源性rhTf分子量比去糖基化hTf標準的分子量稍大（圖3a）。最可能的原因是增加了6xHis標簽（900 Da）和增加到植物源性rhTf的C末端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER保留的信號主題KDEL（6

17、00 Da）。此外，以前的觀察表明酶裂解了兩個碳水化合物鏈的天然hTf的分子量，如SDS-PAGE證明的那樣，小于計算出的hTf的理論分子量（Riebe and Thorn, 1991）。然而，植物源性rhTf分子量的提高不可能是因為植物源性rhTf的信號肽序列的不完全處理。我們先前已證實動物蛋白的天然信號肽在植物細胞內(nèi)是正確加工處理的（Ma et al., 2005; Wang et al., 2008），這也進一步被其他人證實（Menassa et al., 2001; Bortesi et al., 2009）。植物源性rhTf保持其體外可逆地結合鐵的能力因為hTf的主要功能包括裹鐵和隨

18、后的運輸，植物源性rhTf以體外隔離鐵的能力為特征。His-purified的植物源性rhTf樣本經(jīng)過體外處理以獲得蛋白的或者分離形式apo form（游離鐵）或者整體形式holo form（結合鐵）（具體細節(jié)見試驗程序）。然而，分離的hTf和整體的hTf都具有生物活性，每一種都在465-280nm存在典型的吸光率，而整體的hTf有0.045-0.054的A465/A280率（Huebers et al.,1981）。因此，A465/A280率處理可以用來評估植物源性rhTf的鐵飽和度的程度。有鐵存在時，His-purified的植物源性rhTf存在0.052的A465/A280率，與整體的h

19、Tf標準相似，但是與卵清蛋白（OVA）相比有顯著不同（P0.05）（表格1）。因此，鐵存在時吸光度值下降，PH下降（表格1）。非相關的卵清蛋白顯示，在有或沒有鐵時A465/A280率沒有變化。放在一起，這些結果表明植物源性rhTf保持了其體外高親和力的裹鐵能力。植物源性rhTf抑制細菌生長植物源性rhTf的生物活性通過其抑制細菌的生長而評估。假單胞菌（ATCC 27853），一種革蘭氏陰性菌，廣泛用于評估抗菌藥物的一種參考菌株（Fass and Barnishan, 1979; Giacomettiet al., 1999）。為了檢驗其抑菌效果，His-purified的植物源性rhTf（分離

20、形式）或商業(yè)的分離式hTf標準加入到接種了銅綠假單胞菌的培養(yǎng)基，在不同潛伏期通過測量600nm（OD600）時的光密度，按時間尺度上檢測細菌生長。正如圖4示，包含100ug/mL植物源性rhTf（分離型rhTf）或分離型hTf標準的培養(yǎng)基中，與單獨培養(yǎng)基或添加來自野生型81V9的植物蛋白的控制培養(yǎng)基相比，不能完全抑制銅綠假單胞菌的生長，但是能夠顯著地推遲9-19h接種（P0.05）。在有或沒有植物源性分離型rhTf、商業(yè)性分離型hTf或控制性TSP時，細菌生長至相同的細胞密度需25h。添加了低濃度（50ug/mL）的植物源性分離型rhTf、商業(yè)性分離型hTf也表現(xiàn)出了對銅綠假單胞菌生長的抑制作

21、用，但與控制組相比沒有達到統(tǒng)計性差異（數(shù)據(jù)未顯示）。植物源性rhTf對銅綠假單胞菌生長的抑制程度，即使不好，也與使用商業(yè)分離型hTf標準觀察到的相似（圖4）。植物源性rhTf刺激哺乳動物細胞生長研究證實轉鐵蛋白對體外細胞增殖有深遠影響（Barnes and Sato, 1980a,b; Ozawa,1989）。此外，hTf是無血清培養(yǎng)基中大多數(shù)動物細胞的長期生存必需的（Barnes and Sato, 1980a,b）。為了證明植物源性rhTf在體外是否能刺激哺乳動物細胞增長，His-purified的植物源性rhTf與商業(yè)性hTf在刺激希拉HeLa細胞和鼠腎臟腎小管上皮細胞生長方面做了比較。

22、加了濃度20ug/mL的His-purified的植物源性整體型rhTf的無血清SFF12培養(yǎng)基明顯地在體外刺激了HeLa細胞的生長（圖5）。第4天時，添加了整體型rhTf的培養(yǎng)基中的活細胞總數(shù)與初始細胞數(shù)目相比增加了15多倍（圖5a）?；罴毎麛?shù)目的增加率，與使用了商業(yè)性整體型hTf標準的培養(yǎng)基中觀察到的相比，即使不好，也是相似的。果如所料，在未添加任何形式hTf的無血清SFF12培養(yǎng)基中活細胞數(shù)目，在接種4天后下降。座位正控制組，添加了10%（v/v）胎牛血清FBS的SFF12培養(yǎng)基獲得了最高的活細胞計數(shù)，在培養(yǎng)第4天后活細胞數(shù)目增加了20多倍。相同濃度下，植物源性分離型rhTf或商業(yè)性分離

23、型hTf也引發(fā)了顯著地希拉細胞生長（在植物性分離型rhTf或分離型hTf標準存在時，培養(yǎng)第4天后，活細胞數(shù)目超過或大約增長了10倍），雖然與整體型的相比影響并不顯著（圖5a）。更低濃度（2ug/mL）的植物源性rhTf，如商業(yè)性hTf，在刺激HeLa細胞生長中仍表現(xiàn)出顯著影響效果，整體型比分離型表現(xiàn)出更好的刺激效應（圖5b）。同樣研究了植物源性rhTf對鼠腎臟腎小管上皮細胞（細胞株NG1.1）生長的刺激效應。通過測量3H胸腺嘧啶提取物來評估發(fā)生于NG1.1細胞系中DNA的合成量級，來評估植物源性rhTf的刺激效應。濃度10ug/mL的植物整體型rhTf或商業(yè)性整體型hTf顯著增加3H胸腺嘧啶提

24、取物（P0.05），雖然最高的3H胸腺嘧啶結合率發(fā)生在添加了濃度10%（v/v）FBS的K1培養(yǎng)基的正控制組中的細胞生長（圖6）。沒有轉鐵蛋白的無血清K1培養(yǎng)基中細胞生長沒有或很少3H胸腺嘧啶提取物。添加了植物源性分離型rhTf或商業(yè)性分離型hTf的細胞培養(yǎng)基，也顯著地增加了3H胸腺嘧啶提取物，但是與添加整體型的NG1.1細胞系中觀察到的相比，3H胸腺嘧啶結合率降低了（圖6）。低濃度（2ug/mL）的植物源性rhTf或商業(yè)性hTf，各自對3H胸腺嘧啶細胞提取物出現(xiàn)輕微影響（數(shù)據(jù)未顯示），表明了劑量依賴性反應。植物源性rhTf保持了其內(nèi)化進入哺乳動物細胞的能力內(nèi)化進入哺乳動物細胞，是hTf的一種

25、重要特性（Ashida et al., 2004）。為了進一步描述植物源性rhTf的生物活性，用希拉細胞系，在體外分析了植物源性rhTf內(nèi)化進入活體哺乳動物活體細胞的能力。hTf內(nèi)化進入哺乳動物細胞，涉及兩步驟，包含結合hTf至細胞表面特定受體，然后hTf內(nèi)化入細胞（Hopkins, 1983）。內(nèi)化的hTf與細胞表面hTf，可以通過細胞裂解之前使用乙酸/生理鹽水溶液初步處理細胞而辨別（Haigler et al., 1980; Karin and Mintz, 1981）。為了驗證植物源性rhTf是否內(nèi)化入哺乳動物細胞，His-purified的植物源性rhTf孵育的希拉細胞，經(jīng)過乙酸/生理

26、鹽水溶液處理以去除細胞表面植物源性rhTf。細胞裂解后，內(nèi)化的植物源性rhTf釋放，可通過ELISA定量檢測。如圖7a示，在離心分離植物源性rhTf刺激的希拉細胞并移除細胞裂片之后，rhTf可以很容易地在上層裂解液中發(fā)現(xiàn)。植物rhTf中的細胞濃度與商業(yè)hTf刺激的希拉細胞來源的裂解上清液中得到的相似。此外，內(nèi)化的hTf量與添加入希拉細胞培養(yǎng)基中的hTf量很相關。希拉細胞裂解物中，沒有可檢測水平的內(nèi)源性hTf蛋白。與分離型相比，整體型植物源性rhTf或商業(yè)性hTf更容易被體外希拉細胞吸收（圖7a）。內(nèi)化的植物源性rhTf的可視性可以通過免疫印跡分析同樣的裂解物而確定。圖7b表明抗rhTf抗體對預

27、期大小的hTf的蛋白帶有特別反應，表明植物源性rhTf在希拉細胞中仍保持相當穩(wěn)定。植物源性rhTf可作為治療藥物的載體我們的一個長期目標是開發(fā)植物源性rhTf作為特定靶細胞的新的載體分子或送遞口服多肽和蛋白治療藥物。為達到此目的，我們在植物中另外產(chǎn)生了兩個融合蛋白rhTf-GLP-1和rhTf-GLP-1x10并首先探究是否植物源性rhTf融合蛋白能內(nèi)化進入哺乳動物細胞中，如體外希拉細胞。GLP-1（7-36）是一種小的抗糖尿病肽激素，由30個氨基酸組成，分子量大約3.3kDa（Holst, 2007），然而，GLP-1x10是一種合成肽段，包含著10個GLP-1序列的重復拷貝單元，分子量大約

28、33kDa（Brandsma et al., 2009）。植物源性rhTf-GLP-1和rhTf-GLP-1x10分子量分別大約為79和110kDa（圖2b）。內(nèi)化的植物源性rhTf融合蛋白通過ELISA定量檢測。如圖8a示，His-purified的植物源性rhTf-GLP-1或rhTf-GLP-1x10（分離型）孵育的希拉細胞裂解物上清液中包含的融合蛋白，與植物源性分離型rhTf或商業(yè)性分離型rhTf控制組孵育的希拉細胞裂解物上清液中包含的融合蛋白相比，水平略微升高或近似，這表明融合蛋白不干擾hTf內(nèi)化進入細胞的能力。正如所料，單純無血清F12培養(yǎng)基孵育的希拉細胞裂解物上清液或單純GLP-

29、1肽段或GLP-1控制組孵育的希拉細胞裂解物上清液包含不可察覺水平的hTf。利用抗hTf抗體對相同裂解物上清液進行免疫蛋白印跡分析證明了預期大小融合蛋白的存在（圖8b）。討論人類血清Tf，盡管被認為是一種裹鐵蛋白，是一種具有多種生物活性的多功能蛋白（Gomme et al., 2005）。hTf的多功能性，使其在多種不同的應用中相當有用，尤其是在作為治療人類轉鐵蛋白缺乏癥、IR損傷、感染轉移和心血管疾病的藥物，也可作為一種新功能有效的特種癌細胞藥物送遞或靶向口腔給藥的載體系統(tǒng)（Hayashi et al., 1993; Laske et al., 1997; de Vries et al.,

30、2004; Widera et al., 2004; Bai et al., 2005）。為然而，使這些治療或應用更適合大規(guī)?；颊呷后w，需要有大量高質(zhì)量rhTf的可負擔得起的來源。近來制取rhTf的方法證明是困難和效率地下的。本研究中，轉基因植物經(jīng)測試證明是一種新的生產(chǎn)rhTf系統(tǒng)。為達到此目標，生產(chǎn)出攜帶本構體CaMV 35S啟動子控制下的hTf基因的轉基因低生物堿、無尼古丁煙草。利用抗hTf抗體而行的免疫蛋白印跡法證明了rhTf的積累（圖2）。直接ELISA顯示，rhTf蛋白積累量達到TSP的0.25%（或高達33.5/g鮮葉重）。相關的植物源性rhTf的高水平積累可能是由于幾種有協(xié)同作用

31、的因素，包括蛋白質(zhì)本身穩(wěn)定特性，使用強力的CaMV 35S啟動子外加5-UTL序列，使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)目標信號KDEL使rhTf進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER腔的目標。人血清Tf是指一種單一多肽鏈蛋白，包含19個有助于其長期穩(wěn)定的分子內(nèi)雙硫鍵（Mazurier et al., 1983）。此外，C末端KDEL的結合有助于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位，促進蛋白質(zhì)的高水平積累（Ma et al., 2005;Wang et al., 2008）。人血清Tf是在其羧基末端區(qū)Asn413和Asn611包含兩個潛在N鏈接糖基化位點的一種糖蛋白，碳水化合物構成了其大約5%的分子量（Spik et al., 1975; MacGillivray e

32、t al., 1998）。去糖基化分析的結果顯示植物源性rhTf是非糖基化的（圖3）。許多因素可以影響重組蛋白占據(jù)的糖基化位點，例如多肽和蛋白質(zhì)結構、主要種類的類型、壓力和生長情況（Yet and Wold,1990）。在真核細胞，N鏈的糖基化常共翻譯地出現(xiàn)。因此，可能存在空間競爭和暫時的翻譯、糖基化和折疊。因為蛋白質(zhì)折疊常通過二硫化鍵形成而完成，形成的雙硫鍵有效窗口影響了特定蛋白N鏈糖基化的效能。當潛在糖基化位點通過折疊過程而被掩飾，糖基化即被阻止。因為hTf包含多達19種分子內(nèi)雙硫鍵，雙硫鍵形成的優(yōu)勢性過程可使得植物源性rhTf上形成N鏈糖基化的時間大大縮短。Allen et al.（19

33、95）證明低濃度的二硫蘇糖醇（DTT）還原劑阻止了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER中的二硫鍵形成，且導致細胞培養(yǎng)中的重組組織型纖溶酶原激活物（t-PA）的完全糖基化，而這常要經(jīng)過變量醣化作用。Miletich和Broze（1990）證實占據(jù)蛋白C非標準Asn-X-Cys序列的部分糖基化位點可能是通過二硫鍵形成而導致位點阻塞。然而，不管這是否正確，糖基化在hTf的功能中有重要作用。Mason et al.（1993）比較了幼倉鼠腎細胞源性糖基化rhTf和非糖基化突變型rhTf的受體結合力，得出結論：結合在希拉S3細胞的非糖基化突變型rhTf的結合方式與其他三種有相同活性的hTf對照試樣和與程度相同的糖基化rhTf相同

34、。Sargent et al.（2006）報道，酵母菌來源的rhTf缺乏糖基化，與酵母菌來源的非糖基化rhTf與天然糖基化rhTf相比，在其結合鐵的能力和在細菌培養(yǎng)基中作為生長因子的效能上，沒有表現(xiàn)出差異。我們的研究表明進一步表明，糖類在hTf的生物活性上沒有起到多大作用。植物源性rhTf的生物活性使用銅綠假單胞菌菌株而評估。植物源性rhTf表現(xiàn)出了劑量依賴性的抑菌效能，與商業(yè)性分離型hTf標準類似。存在100ug/mL的His-purified的植物源性rhTf或標準分離型hTf時，銅綠假單胞菌的生長率在接種后9-19h明顯下降（圖4；P0.05），雖然經(jīng)過處理的細胞最后還是達到了與其后的控

35、制組細胞相同的密度。長期抑制細菌生長性能的缺乏，可能反映了培養(yǎng)基中有鐵存在時，植物源性分離型rhTf或標準分離型hTf的可能的飽和度。鐵是幾乎所有微生物生長增殖的一個重要營養(yǎng)元素。通過在培養(yǎng)基中隔絕鐵，hTf使微生物得不到鐵。缺乏鐵將會延緩生長和繁殖，而不是殺死細菌。近來研究發(fā)現(xiàn)鐵飽和度完全破壞了轉鐵蛋白和乳鐵蛋白的抑制作用，使得許多微生物能再生（Lankford, 1973; Bullen and Armstrong, 1979; Finkelstein et al., 1983）。乳鐵蛋白是結合鐵蛋白的轉鐵蛋白家族的一員，有高度相似的序列（61.4%相同），與hTf結構相似，因其更大的結合

36、鐵親和力而表現(xiàn)出比hTf更大的抗菌活性（MacGillivray et al., 1983; Wally and Buchanan, 2007）。發(fā)展和常規(guī)使用無血清培養(yǎng)基（SFM），從工業(yè)和科學的觀點其傳統(tǒng)血清成分使研究復雜化對哺乳動物細胞而言是高度優(yōu)先的（Salis et al., 2002）。從工業(yè)角度而言，SFM在減少或消除動物源性成分的使用上非常重要的（Castle and Robertson, 1999），因此避免細菌、病毒、支原體污染。因其是確定成分培養(yǎng)基，與含血清培養(yǎng)基相比，有最低限度的批量（bitch-to-bitch）變異，因此提高了目標產(chǎn)物的穩(wěn)定的質(zhì)量和可重復性（Chu

37、and Robinson, 2001）。向基礎培養(yǎng)基中加入最普通的非血清成分有生長因子，如轉鐵蛋白、胰島素（Barnes, 1987; Fitzsimmons et al., 2004）。然而，重組胰島素普遍用作SFM培養(yǎng)基的添加物，用于SFM的轉鐵蛋白一般是動物源性的，導致與動物源性成分相關的安全憂慮。此外，缺乏商業(yè)可用的hTf，高hTf費用的挑戰(zhàn)。近來，DeltaFerrinTM，一種酵母菌源性的不含動物成分的rhTf已由Dwltw Biotechnology Ltd.研發(fā)（Nottingham,U.K.），在哺乳動物培養(yǎng)基SFM中用做鐵螯合劑。Keenan et al.（2006）證明，

38、通過短期分析和長期的繼代培養(yǎng)（MDCK,BHK-21, PPI-C16 and Vero-PPI）的驗證，DeltaFerrinTM與天然整體型hTf在支持數(shù)種哺乳動物細胞株生長方面作用等同。雖然結果令人振奮，但是酵母菌源性rhTf可能受生產(chǎn)量和費用的限制。植物可以作為具成本效益的替代物。我們的數(shù)據(jù)顯示植物源性rhTf能夠刺激以劑量依賴方式培養(yǎng)在SFM培養(yǎng)基中的HeLa細胞或鼠腎小管上皮細胞的能力，即使不比商業(yè)hTf好，也是令人鼓舞人心的等同作用（圖5a、b，圖6）。這些結果顯示，植物源性rhTf有在細胞培養(yǎng)中替代人源性或牛源性轉鐵蛋白的潛力，取消了動物源性成分的使用。與分離型相比，整體型植物

39、源性rhTf或者商業(yè)性rhTf標準有更有效的生長刺激效果，表明細胞生長中鐵的重要性和hTf在轉運鐵進入細胞的作用。這些結果與以前的研究結果是一致的，即：在添加了激素的SFM培養(yǎng)基中作為支持細胞生長的因素，整體型hTf好于分離型hTf（Kan and Yamane,1984; Alvarez-Hernandez et al., 1998）。添加了FBS的SFM培養(yǎng)基比添加hTf的SFM培養(yǎng)基，在HeLa細胞或鼠腎小管上皮細胞表現(xiàn)出了更好的生長（圖5）。這可能是由于血清中仍然存在細胞生長需要的多種不同生長因素的原因（Barnes, 1987）。轉鐵蛋白是一種轉運鐵的蛋白，經(jīng)由受體介導的內(nèi)吞作用結合

40、并轉運鐵進入細胞。這個過程涉及了兩個截然不同的步驟，包含hTf結合至細胞表面受體和隨后的hTf內(nèi)化。近期工作中，我們檢驗了植物源性rhTf內(nèi)化入哺乳動物細胞例如人類希拉細胞的能力，將開發(fā)特定轉運肽或蛋白質(zhì)藥物入靶細胞或經(jīng)由口腔途徑轉運的植物源性低成本hTf融合系統(tǒng)，作為我們的一個長期研究目標。作為藥物送遞系統(tǒng)的hTf，提供了幾個獨特的優(yōu)勢，包括hTf結合蛋白質(zhì)藥物的高效率轉運進入靶細胞，例如癌細胞，和延長血清半衰期和提高結合蛋白的治療療效。OKeefe和Draper（1985）報道hTf結合蛋白白喉毒素對于培養(yǎng)的胸苷激酶缺乏的鼠L（LMTK）細胞是高細胞毒性的，與單純的白喉毒素相比敏感性改了大

41、約10000倍。此外，hTf抵抗腸胃消化，結合和內(nèi)化到人類腸道上皮細胞，越來越多的證明其作為潛在的具有治療作用的蛋白質(zhì)口服遞送系統(tǒng)（Widera et al., 2004; Baiet al., 2005）。我們的ELISA數(shù)據(jù)顯示植物源性rhTf的內(nèi)化進入希拉細胞是劑量依賴式的，效能與商業(yè)性hTf相似（圖7）。植物源性整體型rhTf或商業(yè)性整體型hTf的內(nèi)化效能比分離型的要高。這可能反映了兩類hTf對于存在于希拉細胞上的hTf受體的親和力的差異。整體型hTf在生理PH下比分離型hTf有更高的hTf受體親和力。當細胞內(nèi)化過程主要取決于受體調(diào)節(jié)時，在受體親和力上的差異將決定hTf內(nèi)化入細胞的效率

42、（Li and Qian, 2002）。ELISA法證明，植物源性rhTf-GLP-1或rhTf-GLP-1x10孵育的希拉細胞裂解物上清液，與相同濃度的植物源性rhTf或商業(yè)性分離型hTf標準孵育的希拉細胞裂解上清液中的內(nèi)化蛋白相比，含有相似或更高水平的內(nèi)化重組融合蛋白（圖8）。這個結果有重要的影響。一個是融合蛋白并不影響植物源性rhTf內(nèi)化進入哺乳動物細胞的能力。成功使用植物rhTf作為載體靶向送遞多肽和蛋白類藥物是非常關鍵。另一意義是 內(nèi)化的hTf融合蛋白可能減少了反向循環(huán)至細胞表面的率，與通過融合伴侶引起的結構改變所導致的未改性hTf相比，因此，融合蛋白可能潛在內(nèi)化后的一長段時間內(nèi)保留

43、在細胞內(nèi)。這或許有助于最大限度地發(fā)揮Tf結合蛋白藥物的治療效果。雖然有用，但內(nèi)化后Tf回到細胞表面的快速再循環(huán)可能顯著阻礙它作為藥物載體的效能。例如，K562細胞（人紅白血病源性細胞株）上進行的hTf轉運研究顯示，整個hTf周期僅維持4 - 5分鐘，在觀察到對細胞的毒性作用之前，需要30次這樣的Tf毒性結合轉運逐次循環(huán)（Klausner et al.,1983; Johnson et al., 1988）。免疫蛋白印跡分析顯示，植物源性rhTf融合蛋白在體外哺乳動物細胞內(nèi)是穩(wěn)定的（圖8b）?？偲饋碚f，在轉基因植物中，沒有報告有hTf的產(chǎn)生。在此，我們報告了在轉基因植物中生產(chǎn)出rhTf，并證明植

44、物源性rhTf保留了許多與天然蛋白質(zhì)相同的功能。雖然hTf有許多潛在應用價值，但它尤其在醫(yī)學應用領域有巨大的意義，例如在人類轉鐵蛋白缺乏癥的治療、IR傷害、心血管疾病和其作為藥物送遞系統(tǒng)的有效性；當前使用傳統(tǒng)表達系統(tǒng)的rhTf的小量生產(chǎn)率制約了其廣泛應用。植物會通過提供大量、高質(zhì)量、低成本的rhTf來提供解決辦法。此外，當前的工作表明植物源性rhTf有潛力成為一個引人注目的特定細胞或口腔送遞多種治療分子的新送遞系統(tǒng)，允許其為未來的廣譜疾病開發(fā)新的治療藥物的可能性。實驗步驟構建植物表達載體OriGene獲得了cDNA克隆編碼的hTf（Rockville,MD, USA）。hTf的cDNA序列可以

45、通過應用設計的正向（5-ATGATATCATGAGGCTCGCCGTGGGAGC-3）和反向（5-AATCTAGATTAAAGCTCATCCTTATGATGATGATGATGATGAGGTCTACGGAAAGTGCAGGC-3）啟動子pCMV6質(zhì)粒聚合酶鏈反應（PCR）得到擴增。正向引物結合了一個EcoRV位點（下劃線）立即從起始密碼子（粗體）的上游開始。反向密碼子包含了一個改良的6組氨酸片段（下劃線），后面是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER保留信號KDEL（斜體），終止碼（雙下劃線）和Xbal位點。按以下參數(shù)進行PCR擴增：94下45s變性，55下45s退火，72下2min延長，共35循環(huán)，最后72下10min延

46、長。得到的PCR產(chǎn)品平齊末端結扎至pUC19的Hincll位點，以產(chǎn)生DNA測序證實的完整pUC19-hTf質(zhì)粒序列（Sequencing Facility; Robarts Research Institute, London, ON,Canada）。hTf開放讀框架，作為EcoRV/Xbal片段解除pUC19-hTf，并結扎至pBlueUTL在Xbal/Smal以產(chǎn)生PUTL-hTf。pBlueUTL質(zhì)粒來源于pBluescript II SK(-)，包含一個克隆的5UTL序列從pRTL-GUS解除的TEV（Carrington and Freed, 1990）作為EcoRI/Ncol片段

47、，Ncol位點移除綠豆核酸，處理并在EcoRI和Smal位點之間插入pBluescript II SK(-)。UTL-hTf序列作為Xhol/Xbal片段從PUTL-hTf解除并結扎至pRTL-GUS，通過替換UTL-GUS以產(chǎn)生pRTL-hTf質(zhì)粒。pRTL-GUS質(zhì)粒包括增強的花椰菜花葉病毒（CaMV）的雙35S（e35S）啟動子和胭脂氨酸合酶（NOS）終止子序列。pRTL-hTf中hTf的3Xbal位點由Xbal消化破壞，克萊治療（Klenow treatment）和其后的平齊末端結扎。完整表達卡座作為Sphl片段，從pRTL-hTf上移除，克萊處理并在Smal插入pBluescript

48、 II SK(-)以產(chǎn)生pBlue35S-hTf。完整表達卡座從pBlue35S-hTf上移除，作為Sall/Xbal片段為其后克隆轉化成二元植物轉移菌pBIN 19（Bevan, 1984）生成最終植物轉化菌pRJC-hTf。質(zhì)粒pRJC-hTf用于構建新質(zhì)粒，表達了一種由hTf和30氨基酸肽類激素胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）（hTf-GLP-1）或其衍生物（hTf-GLP-1x10）組成的融合蛋白。通過熔斷合成的DNA序列編碼GLP-1或GLP-1的10串聯(lián)重復（hTf-GLP-1x10）（Brandsma et al., 2009）到hTf編碼序列的3末端來做到這一點。6xHis標簽

49、和KDEL序列放置到融合蛋白的3末端以促進在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的純化和保留。生成轉基因植物所有的植物轉化菌轉入土壤桿菌LBA4404，通過三親交配（Maet al., 2005）然后按Horsch等（）的方法引入低生物堿煙草cv. 81V9。主要轉基因植物通過包含卡那霉素的培養(yǎng)基篩選。隨著再生植物的成熟，它們就被轉移到溫室內(nèi)并培養(yǎng)以便進一步分析。通過和篩選理想的轉基因植物利用苯酚/氯仿技術萃取總基因組（Ma et al., 2005）。通過使用特定的引物，總基因組DNA經(jīng)過PCR以確認轉基因整合進入植物核基因組。對于RT-PCR分析，按照制造商的說明利用Trizol試劑提取工具（Invitrogen, C

50、arlsbad, CA, USA）萃取總植物RNA。為引發(fā)最初的綜合反應，大約0.5 ug的低聚糖（dT）12-18引物退火為5ug的純化RNA，12uL的總反應體積、7010min。cDNA的生成是在加了20USuperScriptTMII核糖核酸酶H逆轉錄酶（Invitrogen），經(jīng)過42、50min孵育后再經(jīng)過70、15min的孵育。利用特定引物對，在100uL的總反應體積中，大約有150ng首批合成的cDNA作為模板以行PCR擴增。rhTf在轉基因植物中的積累通過PCR證實插入植物基因組的轉基因有正面效應RT-PCR證實轉基因表達的轉基因植物，通過轉基因蛋白的積累經(jīng)SDS-PAGE和

51、免疫印跡法進行了分析。簡言之，轉基因煙草植物的最上面的葉子組織，經(jīng)過液氮混勻且經(jīng)冷的緩沖萃取液中重懸浮25 mM Tris(pH 7.0), 50 mM NaCl, 2 mM b-mercaptoethanol, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, 2 lg mL pepstain A and 2 lg mL leupeptin。經(jīng)過4、13000g、10min的離心分離獲得上清液?？扇苄缘鞍踪|(zhì)總濃度由Bradford方法決定，使用Bio-Rad蛋白染色分析劑和以BSA作為蛋白標準。蛋白樣本在樣本緩沖液中煮沸10min，在12.5%（w/v）的SDS-PAGE

52、凝膠中分離并利用半干傳輸法用聚二氟乙烯（PVDF）薄膜標記。在37的含5%脫脂牛奶的TBS-T20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.02% (v v) Tween 20, adjusted to pH 7.6中封閉1h，薄膜在1:500(V/V)稀釋濃度的山羊抗hTf單克隆抗體中孵育2h，然后在兔抗山羊二抗結合辣根過氧化物酶中孵育（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA）。根據(jù)制造商的說明，通過增強化學發(fā)光反應組件，每個位點上檢測到的蛋白帶。植物源性rhTf的定量檢測轉基因植物中積累的rhTf數(shù)量，采用間接酶聯(lián)免疫吸附測定

53、（ELISA）而量化，與作為蛋白標準的已知量的hTf參考蛋白對比。簡言之，在碳酸氫鈉（pH9.6）重懸過的總蛋白樣品在96孔板中4孵育過夜。每孔用PBS-T洗三次phosphate buffered saline containing 0.05% (v v) Tween-20，室溫下在加了3%（V/V）BSA的PBS-T中培養(yǎng)2h。PBS-T洗后，添加稀釋至1:5000(v/v)的羊抗hTF單克隆抗體并4過夜。三次PBS-T洗后，添加辣根過氧化物酶結合豬抗羊IgG抗體，室溫下孵育1h。根據(jù)廠商說明添加四甲基聯(lián)苯胺酶底物，黑暗環(huán)境下室溫孵育30min。通過每孔添加100uL終止液來終止底物反應。

54、微板塊讀取器在450nm測量光密度值(OD)，通過標準參考hTF蛋白構建的ELISA參考標準曲線，轉換成總提取蛋白質(zhì)的百分比。植物源性rhTf的His-purification按照廠商說明，利用HiTrap螯合HP柱體通過組氨酸親和層析，通過轉基因煙葉提取物純化獲得植物源性rhTf。簡言之，在溫室生長6周的煙草植物最上面完全展開的葉子(5克)的樣本，在前述的1:4(vv)的樣本和緩沖液比例的蛋白質(zhì)提取緩沖液中混勻。勻漿在4下13000g離心15min。收集上清液，4、13000g再次離心10min?？偣彩占蠹s5毫升上清液，加入HiTrap螯合HP柱體，緩沖液洗10 mM imidazole,

55、 20 mM Na2HPO4, 500 mM NaCl，用于去除非特異性內(nèi)源性煙草蛋白質(zhì)。通過洗脫緩沖液500 mM imidazole,20 mM Na2HPO4, 500 mM NaCl，植物源性rhTf通過柱體，1mL留作后續(xù)研究分析。洗脫的rhTf部分，用大量PBS析出，通過4真空凝聚。植物源性rhTf的酶與化學去糖基化植物源性rhTf地位的糖基化狀態(tài)，通過兩酶和化學去糖基化方法得到證明。對于酶去糖基化，按照廠商說明，用縮氨酸-N糖苷酶F（PNGases F）消化植物源性總蛋白提取液和His-purified的rhTf。商購得去糖基化hTf作為陽性對照組。在酶處理之前，樣品在變性緩沖液

56、中煮沸10分鐘而變性。對于化學去糖基化，His-purified的rhTf按照前述的變性，并按照廠商說明經(jīng)GlycoProfile IV化學去糖基化試劑處理。所有經(jīng)處理的樣本通過12.5%SDS-PAGE分析，然后用抗hTf抗體做免疫蛋白印跡檢測。體外鐵結合檢驗植物源性rhTf絡合鐵的能力，通過微小改良Lim等所描述的分光光度法而測定(2004)。簡單地說,大約5毫克的His-purified 的植物源性rhTf，添加到1毫升含過量鐵的溶液FeNH4(SO4)2 dissolved in 0.1 M NaHCO3 to make1 10)3M Fe3+.。溶液在室溫條件下1 h，稀釋10倍后在

57、465和280nm的吸光度測量。鐵飽和人類轉鐵蛋白(holo-hTf) 有一個已描述吸收比0.045 - -0.054(A465A280)，而人類無鐵apo轉鐵蛋白(apo-hTf)有一個大約0.02的A465A280比。商業(yè)性人類apo-hTf和holo-hTf作為陽性控制組，而無關蛋白OVA被作為陰性對照組。植物源性整體型rhTF的制備從A465A280 OD比判斷，His-purified 植物源性rhTf不含鐵(例如，分離型的生產(chǎn))。為了制備其整體型的，His-purified的植物源性rhTf在結合鐵緩沖液中，冰上30分鐘孵育280 lM FeNH4(SO4)2。6H2O titra

58、ted with 1 MNaHCO3，然后進行廣泛的PBS透析。透析后，濃縮樣本，經(jīng)處理樣品的鐵飽和度水平通過閱讀A465A280確定，以商業(yè)holohTf作為標準。植物源性rhTf體外抗菌活性的評價通過植物源性rhTf抑制銅綠假單胞菌的生長能力評估其抗菌活性。簡言之，銅綠假單胞菌桿菌在TB液體培養(yǎng)基中過夜生長胰蛋白胨12 gL、酵母提取物24 gL、甘油4毫升、pH值7.4 在600nm(OD600)光學密度約0.7。隔夜培養(yǎng)基稀釋1:500 (vv)至新鮮TB液體培養(yǎng)基，包含His-purified的植物源性rhTf、商業(yè)apo-hTf標準，或者從HiTrap結合HP柱體洗脫的洗脫液，對照組81V9煙葉的TSP提取物，并以最初的OD600作為0時間取值。每3小時取一次OD600的讀值，直到觀察到增長高峰。銅綠假單胞菌在37、250r.p.m.的50-mL的Falcon錐形管中培養(yǎng)。植物rhTF對Hela細胞生長的影響植物源性rhTf對哺乳動物細胞生長和分化的影響，通過哺乳動物HeLa細胞增殖得到證實。人上皮細胞株He