1、病毒的分類,一、 分類原則,核酸的性質(zhì)與結(jié)構(gòu) 病毒大小與形態(tài) 衣殼對稱性和殼粒數(shù)目 有無包膜 對理化因素的敏感性 抗原性 生物學(xué)特性（繁殖方式、宿主范圍、傳播途徑和致病性）,二、病毒分類系統(tǒng)和命名 （一）病毒分類一般系統(tǒng) 病毒分類系統(tǒng)將病毒分類為 科(families)、 屬(genera)、種(species)等三級，或科、亞科、 屬、種等四級。 根據(jù)病毒體的形態(tài)、基因結(jié)構(gòu)和復(fù)制模式 等特征將病毒分為科和亞科； 在科或亞科中又根據(jù)理化特性和血清學(xué)特 性等分病毒屬，屬名后綴為virus，屬下分為 不同的病毒種。,分類 可將病毒分為科、亞科和屬 常用核酸類型分類 1 DNA virus (DNA

2、病毒中有9科 ) 2 RNA virus ( ssRNA 7 科. ssRNA 7 科. dsRNA 2科 ) 3 反轉(zhuǎn)錄病毒 (DNA和RNA反轉(zhuǎn)錄病毒中有2科) 依傳播方式和感染部位分類 1 蟲媒病毒 2 腸道病毒 3 呼吸道病毒 4 肝炎病毒 5 性傳播病毒 （二）非尋常病毒的分類 1 衛(wèi)星病毒（satellites） 2 類病毒（viroids） 3 朊粒（prion）,第三節(jié) 病毒學(xué)診斷 自身免疫病和腫瘤密切相關(guān)。病毒性疾病在人類疾病中占有十分重要的地位。 由于病毒感染的防治原則不同于細(xì)菌等其他微生物，盡早判定病人感染或某傳染病的流行是由病毒所致，是醫(yī)生和微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的責(zé)任和任務(wù)。

3、 病毒的分離與鑒定當(dāng)然是病毒病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但因病毒是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生，病毒分離必須有活的細(xì)胞支持，故病毒的分離鑒定較困難。,一、標(biāo)本的采集、運(yùn)送和處理 1. 應(yīng)在感染早期（發(fā)病12天內(nèi)）采集。 2. 必須無菌操作，對用于病毒分離培養(yǎng)的污染標(biāo)本用 高濃度抗生素處理過夜，必要時(shí)需加抗真菌藥物等 3. 及時(shí)送檢，送檢的組織等可放入含有抗生素的50% 甘油緩沖鹽水或二甲基亞砜中低溫冷藏。 4. 血清學(xué)檢查的標(biāo)本，尤其檢測抗病原體的IgG型抗 體，應(yīng)分別在發(fā)病初期和恢復(fù)期采集雙份血清，只 有當(dāng)恢復(fù)期血清抗體效價(jià)比初期升高4倍或以上， 才具有確診意義。,分離培養(yǎng)鑒定 (污染標(biāo)本用抗生素處理過夜),快速

4、診斷,雞胚 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn),細(xì)胞培養(yǎng) CPE 電鏡檢測 中和試驗(yàn) TCID50 pfu測定 MOI測定,動(dòng)物接種 觀察發(fā)病情況 中和試驗(yàn) 免疫學(xué)檢測 ID50測定 LD50測定,形態(tài)學(xué) 電鏡觀察 病毒顆粒 （大小、 形態(tài)） 光學(xué)顯微鏡觀察 包涵體,抗原 檢測 ELISA IF RIA WB,核酸檢測 核酸電泳 核酸雜交 PCR 基因芯片 基因測序,抗體 檢測 ELISA RIA IF WB,病毒成分檢測,標(biāo)本采集,二、病毒的分離與鑒定 以下情況需考慮進(jìn)行病毒分離與鑒定： 1. 病程長且診斷困難的病人。 2. 懷疑為新現(xiàn)病毒（emergent virus）感染或已被消滅 的病

5、毒性疾病懷疑“死灰復(fù)燃”。 3. 為鑒別臨床上具有相同癥狀的疾病。 4. 監(jiān)測所用減毒活疫苗。 5. 用于病毒生物學(xué)性狀的研究或流行病學(xué)調(diào)查等。,（一）病毒的分離培養(yǎng)1細(xì)胞培養(yǎng)：原代培養(yǎng)細(xì)胞、 二倍體細(xì)胞株、傳代細(xì)胞 系或株 標(biāo)本接種后溶細(xì)胞型感染病毒可致細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病毒效應(yīng)（CPE），穩(wěn)定感染病毒細(xì)胞并不出現(xiàn)明顯病變，但被感染的細(xì)胞膜表面會(huì)表達(dá)病毒蛋白等標(biāo)志物，如血凝素、神經(jīng)氨酸酶、病毒特異性抗原等。2雞胚培養(yǎng)和動(dòng)物接種： 流感病毒的分離培養(yǎng)雖可用犬腎傳代細(xì)胞（MDCK）,但雞胚接種仍是最常用的敏感而特異的方法。 動(dòng)物接種是最原始的分離病毒的方法，但目前少用。,（二）病毒的鑒定1病毒在培養(yǎng)細(xì)

6、胞中增殖的鑒定指標(biāo)（1）細(xì)胞病變（ cytopathic effect, CPE ） 大多數(shù)病毒屬溶細(xì)胞型感染，在敏感細(xì)胞內(nèi)增殖會(huì)出現(xiàn)CPE。CPE表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)顆粒增多、圓縮、聚集、融合，有的可形成包涵體，出現(xiàn)細(xì)胞溶解、脫落、死亡等。 不同病毒的CPE特征不同。因此，觀察病毒所致CPE的特點(diǎn)，根據(jù)細(xì)胞類型，細(xì)胞病變種類可對標(biāo)本中感染的病毒進(jìn)行判定。,脊髓灰質(zhì)炎病毒感染所致CPE a. 未感染的vero細(xì)胞（一種非洲綠猴腎細(xì)胞系） b. 脊髓灰質(zhì)炎病毒感染的vero細(xì)胞（顯示細(xì)胞圓縮、分散 、 壞死、脫落）。,（2）紅細(xì)胞吸附（hemadsorption） 包膜上帶有血凝素的病毒感染敏感細(xì)胞后，

7、 血凝素會(huì)出現(xiàn)于細(xì)胞膜表面，使感染細(xì)胞能與加入的紅細(xì)胞結(jié)合出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，這是檢測正粘病毒和副粘病毒的間接指標(biāo)。 （3）中和試驗(yàn)（neutralization test, NT） 用抗某病毒血清先與待測病毒懸液混合，經(jīng)作用一定時(shí)間后接種敏感細(xì)胞，培養(yǎng)后觀察CPE或 紅細(xì)胞吸附現(xiàn)是否消失，即特異性抗體是否能 中和相應(yīng)病毒的感染。如用不同濃度的抗血清 進(jìn)行中和試驗(yàn)，還可根據(jù)抗體的效價(jià)對待測病毒 液進(jìn)行半定量檢測。,（1）空斑形成試驗(yàn)（plaque formation） （2）50%組織細(xì)胞感染量 （3）感染復(fù)數(shù) （Multiplicity of infection, MOI）,2病毒感染性測定

8、及病毒數(shù)量測定,三、病毒感染的快速診斷 病毒的分離與鑒定是病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用困難，而且費(fèi)時(shí)，對臨床病毒感染癥的診治幫助不大?？焖僭\斷主要指臨床標(biāo)本繞過分離培養(yǎng)復(fù)雜而較長的過程，直接在電鏡下觀察病毒顆粒，或直接檢測標(biāo)本中的病毒成分和IgM抗體等，以作出快速和早期診斷。,（一）形態(tài)學(xué)檢查1電鏡和免疫電鏡檢查 含有高濃度病毒顆粒（107顆粒/ml）的樣品，可直接應(yīng)用電鏡技術(shù)觀察。對含低濃度病毒的樣本可用免疫電鏡技術(shù)，或用超速離心機(jī)將標(biāo)本離心進(jìn)行電鏡觀察，以提高檢出率和特異性。電鏡下不僅能觀察病毒的形態(tài)學(xué)特征，還可測量病毒的大小。2光學(xué)顯微鏡檢查 病理標(biāo)本或含有脫落細(xì)胞及針吸細(xì)胞的標(biāo)本

9、檢測病毒包涵體。包涵體對病毒的診斷有一定價(jià)值。觀察病毒CPE。病理標(biāo)本根據(jù)病理特征，再配合組化染色技術(shù)進(jìn)行診斷。,（二）病毒蛋白抗原檢測 1. 酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA） 2. 免疫熒光標(biāo)記技術(shù)（IF） 3. 放射免疫標(biāo)記（SPRIA） 這些技術(shù)操作簡便、特異性強(qiáng)、敏感性高。尤其使用單克隆抗體標(biāo)記技術(shù)可測到ng（10-9g） 至pg（10-12g）水平的抗原或半抗原。其中由于放射性核酸可引起放射性污染，已逐漸被非放射性標(biāo)記物（如地高辛等）所代替。,（三）早期抗體檢測 1IgM型特異抗體檢測 檢測病毒感染機(jī)體產(chǎn)生的特異性IgM，如孕婦羊水中查到IgM型特異抗體可早期診斷某些病毒引起的胎兒先天性感

10、染；IgM抗體測定有助于早期診斷，但感染機(jī)體產(chǎn)生IgM抗體有明顯個(gè)體差異。 2免疫印跡試驗(yàn)（Western blot, WB） 某些病毒感染的診斷需持慎重認(rèn)真的作法。如AIDS和成人白血病等，在初篩試驗(yàn)陽性后，尚需用WB法進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)。,（四）檢測病毒核酸1核酸電泳：正粘病毒屬和呼腸病毒屬的核酸是分節(jié)段 的，甲型流感病毒8個(gè)節(jié)段，輪狀病毒11個(gè)節(jié)段。從 標(biāo)本中直接提取輪狀病毒的核酸，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠 電泳（PAGE）和銀染色后在凝膠板上清楚核酸條 帶，結(jié)合臨床情況可進(jìn)行診斷。2核酸雜交：其原理是應(yīng)用已知序列的核酸單鏈作為探 針（probe），探針預(yù)先用放射性核素（32P或131I）或 生物素、地高辛苷原、辣根過氧化物酶等標(biāo)記，在一 定條件下按堿基互補(bǔ)規(guī)律與標(biāo)本,（1）斑點(diǎn)雜交（dot blot