1、第一部分 蛋白質(zhì)含量測定方法簡介 一、雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的含量 （一）目的與要求 1.掌握雙縮脲測定蛋白質(zhì)含量的原理與方法； 2.了解比值法在物質(zhì)定量測定中的應(yīng)用。 （二）實驗原理 雙縮脲(NH2CONHCONH2)在堿性溶液中能與Cu2+產(chǎn)生紫紅色的絡(luò)合物（吸收波長540nm)，這一反應(yīng)稱為“雙縮脲反應(yīng)”。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵也能與銅離子發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。溶液顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，而與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及相對分子質(zhì)量無關(guān)。故雙縮脲反應(yīng)可用于蛋白質(zhì)含量的測定。 類脂、色素等干擾比色，本實驗用加入四氯化碳的辦法消除這一干擾。,（三）方法 1.比值法 A=kc 本次方法 A標= kc標 （1）

2、 A樣 =kc樣 （2） （1）式 （2）式 得： A標 A樣 = c標 c樣 ？ c樣 = A樣c標 A標 2.標準曲線法,C（有色溶液中被測成分濃度）,A,溶液吸光度,（四）思考題 1. CCl4在本實驗中的作用是什么？ 2.此法與標準曲線法比較有何優(yōu)缺點？,二、幾種蛋白質(zhì)定量測定方法比較,三、思考題 1紫外吸收法與Folin-酚比色法測定蛋白質(zhì)含量相比，有何缺點及優(yōu)點？ 2若樣品中含有核酸類雜質(zhì)，應(yīng)如何校正？ 3.試說明考馬斯亮藍G250法的優(yōu)缺點。,一、概念、用途、設(shè)備和基本操作 1.概念：離心技術(shù)是利用離心機旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生的強大離心力對大小、形狀和密度不同的混合物進行分離的一種方法。,2

3、.用途： 分離細胞器、大分子物質(zhì)； 固、液相分離； 測定某些純物質(zhì)的個別性質(zhì)。 3.設(shè)備：離心機 4.基本操作：,第二部分 離心技術(shù)簡介,（1）將待分離的物質(zhì)懸浮于一定的介質(zhì)中，裝入離心管； （2）精確平衡之后，對稱放置于轉(zhuǎn)頭的插孔中； （3）當轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)時，各種物質(zhì)粒子在離心力作用下因各自大小、形狀和密度的差異而以不同速度沉降，一段時間后，即被分離。,二、離心（centrifugation）分離的基本原理,t:沉降時間 h:懸浮介質(zhì)的黏度 rp:顆粒半徑 rp:顆粒密度 r：介質(zhì)密度rt:旋轉(zhuǎn)中心到液面的距離 rb:旋轉(zhuǎn)中心到管底的距離 - 角速度,1. 粒子的沉降速度,由公式可知，在一定離心

4、場中，顆粒的沉降速度不僅與離心力有關(guān)，而且與顆粒大小、密度以及介質(zhì)黏度有關(guān)。一組不同的顆粒在同一條件下離心時則可以根據(jù)它們的密度和顆粒大小而分離。,2. 相對離心力 (relative centrifugal foce RCF),離心場產(chǎn)生的離心力的表示： 習慣使用法：轉(zhuǎn)速 轉(zhuǎn)/分（r/min） 缺點：如果旋轉(zhuǎn)半徑不同，則粒子所受的離心力不同,標準法：相對離心力（RCF ） 表示方法：數(shù)字g g為重力加速度，即相對離心 力為重力加速度的倍數(shù) 如：10000g 相對離心力與轉(zhuǎn)速的換算 計算法 RCF = 1.11910-5（r/min)2rg 圖表法 根據(jù)旋轉(zhuǎn)半徑（r）、RCF、r/min 的列

5、線計算圖進行換算,RCF與r/min列線計算圖,已知r和r/min求RCF,已知r和RCF求r/min,三、離心機 (centrifuge),1. 制備離心機,2. 分析離心機 屬于超速離心機，具有光學觀測系統(tǒng)。,制備離心機適用范圍,四、轉(zhuǎn)頭,1. 水平（甩平）轉(zhuǎn)頭,2. 角式轉(zhuǎn)頭,3. 垂直管轉(zhuǎn)頭,4.不同轉(zhuǎn)頭中粒子的軌跡,角式轉(zhuǎn)頭,5.注意事項 各種轉(zhuǎn)頭的離心管腔的大小、形狀均有許多規(guī)格，以適應(yīng)各種轉(zhuǎn)速、樣品量、分離目的、分離方法。需要注意： （1）每個轉(zhuǎn)頭都有一定的使用限度（次數(shù)，運轉(zhuǎn)時間）。 超過限度使用，其最大額定速度應(yīng)降低10%。 二次超限使用，再降10%。 每個轉(zhuǎn)頭必須單獨建擋，

6、記錄使用次數(shù)和最大速度下的使用時間。 （2）轉(zhuǎn)頭上標定的最大額定轉(zhuǎn)速是有條件的。 一般應(yīng)嚴格按條件操作。,五、常用離心技術(shù),1. 沉淀離心 選定一定的時間、速度進行離心，使樣品液中的大的固型物與液體分離，從而獲得沉淀或上清夜。又稱為固液分離法。使用普通離心機 2. 差速分級離心 在均勻介質(zhì)中，利用各種物質(zhì)粒子沉降速度的不同而分批分離的方法。,如線粒體的分離：,原理：利用各種粒子的沉降速度和浮力密度差，當一定粒子到達與其密度相同的梯度位置時則停止沉降，不同粒子處于不同位置，則得到了分離。,3.區(qū)帶離心法,分類： 差速區(qū)帶離心法 等密度區(qū)帶離心法,（1） 差速區(qū)帶離心法,根據(jù)分離樣品顆粒的不同沉降速度而分層。,(2) 等密度區(qū)帶離心法,根據(jù)微粒的不同密度而分層。,用途：是制備高純度物質(zhì)的常用方法 特點：高純度、高分辨力； 不足：復雜,密度梯度材料： 要求：無毒；合理的密度范圍；易于顆粒分開。 類型：糖類（蔗糖）、無機鹽（氯化銫）、硅溶膠（Ludox）、有機碘化物,思考題： 1.相對離心力為30，000g，轉(zhuǎn)頭平均半徑為10cm,求轉(zhuǎn)速r/min （rpm）? （兩種方法:公式法;對數(shù)列表