1、CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其應(yīng)用,CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介 CRISPR-Cas系統(tǒng)作用機理 CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建 載體構(gòu)建、導(dǎo)入目的生物或細胞系、篩選 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的不足之處 提高打靶特異性的策略 小結(jié),1 CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介 1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的來源 成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種廣泛存在于細菌與古細菌中的，由 RNA介導(dǎo)的、可遺傳的獲得性免疫系統(tǒng)。

2、,1.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史 1987 年，日本課題組在K12 大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中，2002 年，正式將其命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列 2005 年發(fā)現(xiàn)CRISPR 的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，推測細菌可能通過CRISPR 系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵。 2007 年，Barrangou 等首次發(fā)現(xiàn)細菌可能利用CRSPR 系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；2008 年，Marraffini 等發(fā)現(xiàn)細菌CRISPR 系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首

3、次利用實驗驗證了CRISPR 系統(tǒng)的功能 2013 年初，MIT 的研究組首次利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對人293T 細胞EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 細胞Th 基因?qū)崿F(xiàn)了定點突變。同年Mali 利用CRISPR/ Cas9 在人293T 細胞和K652 細胞基因的靶位點形成雙鏈或單鏈的切口，從而激活細胞的DNA 修復(fù)機制高效介導(dǎo)外源基因定點插入。,1.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu),CRISPR-CAS系統(tǒng)的組成主要包括:由不連續(xù)的重復(fù)序列R(repeat)與長度相似的間區(qū)序列S( spacers)間隔排列而成的CRISPR 簇，前導(dǎo)序列L(leader) 以及

4、一系CRISPR相關(guān)蛋白基因cas。,1.4 CRISPR-Cas系統(tǒng)的類型,CRISPR/Cas系統(tǒng)有3 種類型，其中，產(chǎn)膿鏈球菌的Type型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸內(nèi)切酶，已經(jīng)在人類細胞、小鼠、斑馬魚中成功實現(xiàn)了基因組定點修飾，目前被廣泛應(yīng)用于真核細胞的基因組編輯中。 型CRISPR/Cas系統(tǒng)包含3個主要基因位點:編碼相關(guān)蛋白的位點（Cas9、Cas1、Cas2、Csn2），編碼含重復(fù)片段的小RNA位點（CRISPR位點）和1個輔助小片段RNA(tracrRNA位點)。,2 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機理,2.1 適應(yīng)：間隔序列的獲得 當外源DNA片段入侵后，CRISPR/

5、Cas識別入侵的核酸和掃描外源DNA潛在的PAM（NGG序列），將臨近 PAM 的序列作為候選protospacer，然后在 CRISPR 基因座的5端合成重復(fù)序列，再將該DNA的1個片段(約20bp)整合到兩個重復(fù)序列之間，從而使得菌體擁有“記憶”。,2.2 表達：表達并加工CRISPR,CRISPR 區(qū)域首先轉(zhuǎn)錄成前體 RNA(pre-crRNA)，之后被Cas蛋白剪切成更小的crRNA，即成熟的crRNA，包含1個間隔序列和部分重復(fù)序列。同時，tracrRNA 也會被轉(zhuǎn)錄并和crRNA形成一種雙鏈的RNA結(jié)構(gòu)，再與Cas9 蛋白組成具有DNA內(nèi)切酶活性的復(fù)合物。,2.3 干擾:干擾入侵核

6、酸,復(fù)合物在 crRNA 的引導(dǎo)下，由 Cas9 蛋白的核酸結(jié)構(gòu)域?qū)ν庠?DNA 分子進行切割。 首先RNA/Cas9 復(fù)合體沿外源入侵DNA進行掃描，當遇到PAM序列且DNA序列可與crRNA互補配對形成一個R環(huán)時，Cas9蛋白將分別利用HNH與RuvC結(jié)構(gòu)域?qū)NA的互補鏈與非互補鏈進行切割，而形成DNA的雙鏈斷裂。,PAM（Protospacer adjacent motif）,在嗜熱鏈球菌中，PAM 序列多數(shù)為5-NGG，而5-NAG 雖然效率低一些，但也可用于靶DNA的定位，可擴展在基因組編輯中靶DNA 的選擇范圍。 介導(dǎo)切割效率依次為：NGGNGANAG 人類基因組中每 8 bp

7、就會出現(xiàn)一個 PAM 在型與型CRISPR/Cas系統(tǒng)中，自身基因組CRISPR序列的下游無PAM序列，從而將自身基因組DNA 序列與外源DNA 序列區(qū)分開，避免自我免疫。,crRNA,成熟crRNA可分為5手柄、 3發(fā)卡結(jié)構(gòu)和間隔序列， 5手柄具有保守性， 3發(fā)卡是核酸內(nèi)切酶識別位點，5端重復(fù)序列均質(zhì)性較 3端好，其與PAMs 一起保護自身CRISPR序列不被誤切。 crRNA末端還含有一段起“種子區(qū)”作用的序列，它決定著尋找靶基因的效率，該區(qū)域僅需1 個位點發(fā)生突變即極可能無法正確識別靶基因，但在種子區(qū)外發(fā)生少量突變則不容易導(dǎo)致識別功能失效。 CRISPR/Cas9 對靶點的識別需要PAM

8、 (NGG)和靠近PAM 的11 bp 的種子序列完全保守，14 bp(PAM+種子序列)序列中的任何一個堿基突變之后CRISPR/Cas9 的切割效率基本降至零。,tracrRNA(trans-activating crRNA),指導(dǎo)RNase和Cas9 完成前體crRNA 的成熟。 tracrRNA 對靶點的識別和切割是必需的，tracrRNA 的5 端與成熟的crRNA 3 端有部分序列(約13 bp)能夠配對進而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，對維持crRNA 與靶點的配對可能十分重要。,Cas9蛋白900-1600個氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白,Cas9,REC-在REC識別區(qū)中的一個富含精氨酸的-螺旋負

9、責(zé)與 RNA-DNA 異源二聚體的3端8 12個核苷酸的結(jié)合 HNH 結(jié)構(gòu)域-在crRNA互補鏈PAM元件上游3 nt處切割。位于HNH 結(jié)構(gòu)域的H840A突變體可導(dǎo)致HNH結(jié)構(gòu)域的失活 RuvC結(jié)構(gòu)域-在非互補鏈PAM元件上游的38nt處切割。位于RuvC 結(jié)構(gòu)域中的D10A突變體可導(dǎo)致RuvC結(jié)構(gòu)域的失活。（ RuvC則分為3個亞結(jié)構(gòu)域:RuvC位于蛋白的N 端，RuvC/分別位于HNH 結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)） PAM結(jié)合區(qū),3 CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建,3.1 sgRNA設(shè)計 目前，大多數(shù)研究將與靶DNA 互補的crRNA 與tracrRNA 融合為一條單獨的引導(dǎo)RNA(sing

10、leguide RNA，sgRNA).將sgRNA 設(shè)計為100 nt 左右，包含位于5端20 nt的DNA 互補區(qū)、crRNA 以及位于3 端70 80 nt 的tracrRNA。 通常設(shè)計的sgRNA 具有二級發(fā)卡結(jié)構(gòu)和1條3端尾，設(shè)計的sgRNA與靶基因有1 3個堿基錯配并不影響編輯效率，但是，靠近PAM元件的12個堿基要嚴格配對.,crRNA/tracrRNA/Cas9,sgRNA/Cas9,目前(2014.10)報道的CRISPR/Cas系統(tǒng)中使用的gRNA有2種結(jié)構(gòu)，一種是M.Jinek等最先提出的，將一部分重復(fù)序列和一部分tracrRNA的序列直接拼接到一起形成的嵌合RNA結(jié)構(gòu)。

11、,另一種與第一種基本相同，只是3端更長，添加了完整的tracrRNA 序列.,關(guān)于2種結(jié)構(gòu)的優(yōu)劣，麻省理工學(xué)院張峰研究團隊做了細致的研究，他們發(fā)現(xiàn)，3端越長，gRNA表達豐度越高，相應(yīng)的打靶效率也越高。為了保證足夠的打靶活性，推薦gRNA的3端長度不低于67nt為好，而長度為85nt時效率最高.,在設(shè)計Guide序列時，需要特別注意第一個堿基必須是G，如果您選取的Guide序列的第一個堿基不是G，需要自行加上一個G，因為這個G對于起始轉(zhuǎn)錄非常重要。 在線工具設(shè)計： 麻省理工學(xué)院的 CRISPR Design：/ 德國癌癥研究中心的 E-Crisp：www

12、./E-CRISP/designcrispr,3.2 NLS,Cas9 蛋白來源于細菌，因此要讓Cas9 蛋白高效地轉(zhuǎn)運到哺乳動物細胞核內(nèi)，需要在Cas9 蛋白的N 端或是C 端加上真核細胞的核定位信號。 對于添加NLS信號的位置，目前尚存在爭議。L.CONG的研究發(fā)現(xiàn)，在Cas9蛋白的N端和C端同時添加NLS信號最能有效的指導(dǎo)Cas9蛋白入核。而P.Mali等在Cas9蛋白的C端添加個NLS信號構(gòu)建的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在人類的細胞中最高可以達到25%的敲除效率，表明在C端添加個NLS信號是足以引導(dǎo)Cas9蛋白進入核中的。但是南京大學(xué)的研究人員卻發(fā)現(xiàn)，無論

13、是在Cas9蛋白的N端添加3個還是在N端、C端同時添加SV40核定位信號均不能使Cas9蛋白進入293T細胞的細胞核中，只有在N端添加核定位信號并且在核定位信號和Cas9蛋白之間加上32個氨基酸殘基的接頭才能指導(dǎo)Cas9蛋白入核。這些不一致的結(jié)果有可能是由于各個研究中FLAG標簽添加位置的不同引起的，但同時也說明Cas9蛋白在折疊過程中可能干擾了NLS信號識別。,4 載體構(gòu)建、導(dǎo)入目的生物或細胞系、篩選,4.1 載體構(gòu)建,Cas9蛋白和gRNA的表達框可以分開放到2個載體上，也可以直接構(gòu)建在同1個載體上，方便Cas9蛋白和gRNA的協(xié)同表達。 這2種策略各有好處。比如，構(gòu)建在同一載體上有利于C

14、as9蛋白和gRNA的協(xié)同表達，這一點非常適合于難轉(zhuǎn)染的細胞。而分開放在2個表達載體上則能更方便快速的對候選的gRNA進行打靶效率和脫靶情況的檢測。構(gòu)建gRNA時，只要基因的序列連接到gRNA骨架上，或者直接合成帶有靶序列的gRNA再連接到表達載體上即可。,4.2 導(dǎo)入目的生物或細胞系 在人工培養(yǎng)的哺乳細胞中，可通過電穿孔(electroporation) 、核轉(zhuǎn)染( nucleofection) 與脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染等方法將非自主復(fù)制的質(zhì)粒DNA 導(dǎo)入細胞中，使Cas9 與sgNA 可進行瞬時表達。 慢性病毒載體( lentiviral vectors) 也已用于在人類或小鼠細胞中組成型表達Ca

15、s9 與sgNA。 體外轉(zhuǎn)錄的NA 也可直接注射導(dǎo)入斑馬魚、果蠅或小鼠的胚胎細胞中 質(zhì)粒越大，成功率越低,4.3 篩選 將Cas9、引導(dǎo)NA 以及一條含有突變位點的靶DNA 的同源重組修復(fù)模板共同轉(zhuǎn)化到目的菌株中。若在Cas9 對基因組靶DNA 序列產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂后，可利用導(dǎo)入的同源重組修復(fù)模板進行DNA 修復(fù)，由于修復(fù)模板在識別互補區(qū)或PAM 位點中存在突變位點而不能被Cas9 再次切割，因而可存活; 而未能進行同源重組修復(fù)的基因組則由于Cas9 的切割降解，無法存活。利用該方法可明顯提高基因組編輯后的篩選效率，且在基因組中不殘留篩選標記。,5 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用,基因組

16、編輯技術(shù)是一種可以在基因組水平上對DNA序列進行改造的遺傳操作技術(shù)。 這種技術(shù)的原理是構(gòu)建一個人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過程中會產(chǎn)生突變，從而達到定點改造基因組的目的。 通過修復(fù)途徑，基因組編輯技術(shù)可以實現(xiàn)三種基因組改造，即基因敲除，特異突變的引入和定點轉(zhuǎn)基因,5.1 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組精確編輯技術(shù),例子：基因敲除的實驗過程,1.在靶基因序列中尋找NGG序列獲得其附近20多個堿基的序列，設(shè)計出sgRNA并合成該序列 2.將sgRNA及cas9基因連入載體 3.轉(zhuǎn)化感受態(tài)，質(zhì)粒小提，測序驗證 4.細胞培養(yǎng)與細胞轉(zhuǎn)染 5.敲

17、除效果檢測 6.建立穩(wěn)定敲除的細胞株,5.2 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活,抑制：在CRISPR/Cas9的型系統(tǒng)中將Cas9中的切割域突變，會使Cas9蛋白失去對的切割活性，但不影響其與 結(jié)合的能力。這種失去切割活性的Cas9蛋白被命名為Dead as9。將Cas9與gRNA在細胞中共表達，則gRNA可以介導(dǎo)Cas9蛋白與 結(jié)合。如果Cas9結(jié)合到靶基因的閱讀框內(nèi)，可阻斷RNA聚合酶的延伸作用；如果Cas9結(jié)合到靶基因的啟動子區(qū)域則可阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始.,激活：將dCas蛋白與具有轉(zhuǎn)錄激活的蛋白質(zhì)功能域融合則可構(gòu)建具有轉(zhuǎn)錄激活活性的CRISPR-on系統(tǒng)。CRISPR轉(zhuǎn)錄激

18、活系統(tǒng)的靶序列位置對激活效率有重要影響。當靶序列與啟動子的距離合適時，激活效率較高；靶序列處于啟動子上游較遠位置激活效率相對下降；當靶序列與啟動子距離過近，或處于開放閱讀框內(nèi)時則會產(chǎn)生抑制效應(yīng)。也就是說使用相同的CRISPR-on系統(tǒng)，不同的crRNA既可以對靶基因激活，也可以抑制靶基因表達。 真核細胞的轉(zhuǎn)錄激活因子可通過將Cas9與單純皰疹病毒轉(zhuǎn)錄激活子16結(jié)合獲得。,5.3 單切口酶,Cas9也可以改造成為單切口酶,只被一個Cas9n（Cas9n為D10A突變的突變體，只能切割與sgRNA直接互補的DNA單鏈）切割產(chǎn)生的單鏈缺口會被高保真性的堿基切除修復(fù)途徑 (base excision

19、repair, BER) 修復(fù)，不會在基因組DNA上造成突變。,5.4 利用多個引導(dǎo)RNA 序列可同時進行基因組上多 個不同位點的編輯. 5.5 將 CRISPR/Cas9 技術(shù)與成像技術(shù)結(jié)合，利用dCas9 的基因組定位功能，使小鼠或人的基因組的元件可視化，用于監(jiān)測活體中各元件的動態(tài)變化 基因組規(guī)模的功能篩選、特定染色體位點的標 記等,6 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的不足之處,脫靶效應(yīng)：早期研究認為crRNA 的間隔序列(spacer)與外源DNA 的靶位點完全互補配對對于切割是必需的，后來的研究證明spacer與protospacer 部分互補配對時切割也可以發(fā)生。CRISPR/Cas系統(tǒng)對打靶位點距離PAM區(qū)較遠的5區(qū)的識別特異性較低，當出現(xiàn)幾個堿基的錯配時，Cas9蛋白仍然會將序列切開，造成脫靶效應(yīng)。 V.Pattanayak等的研究顯示，CRISPR/Cas復(fù)合體的濃度也與脫靶效應(yīng)緊密相關(guān)。當CRISPR/Cas復(fù)合體的濃度較高時，即使錯配發(fā)生在PAM區(qū)內(nèi)部或者靠近PAM區(qū)的位置，DNA切割也仍然會進行，而這種現(xiàn)象在低濃度時則不會發(fā)生。,局限性： CRISPR/Cas9對目的序列的識別與結(jié)合必須有PAM的存在。這就使得該系統(tǒng)對基因組的靶向識別位點被限制