1、一 基本概念,一、放射性核素的選擇： 1 要不改變原化學物的理化和生物學特性；2 要與化學物結合牢固穩(wěn)定； 3 要有合適的物理半衰期； 4 射線容易測量； 5 其它要求 二、幾個重要參數(shù)： 1 放射性濃度；2 放化純度；3 放射性比活度 三、同位素與非同位素標記 四、定位標記與非定位標記,二 放射性核素標記化合物制備方法簡述,1放射性核素標記物制備技術的特點： a 原料；b 標記物的穩(wěn)定性；c 超微量技術；d 進行冷試驗； 2常用的基本方法： a 同位交換法；b 化學合成法；c 生物合成法 放射性碘標記化合物的制備 放射性碘制備分析試劑以125I應用最廣，現(xiàn)90的放免試劑盒中的示蹤劑都是用12

2、5I標記的，因為125I具有二個重要的優(yōu)點，用125I標記的化合物有足夠的穩(wěn)定性。,1 碘的同位素及125I的特性,碘的同位素有29種，其中23種是放射性同位素，它們具有很不同的物理特性，制備分析試劑以125I應用最廣，因為125I具有二個重要的優(yōu)點，一是半衰期（60天）允許標記化合物可貯存應用一段時間；二是它只發(fā)射28Kev能量的x射線和5Kev的射線，無粒子， 因而輻射自分解少，標記化合物有足夠的穩(wěn)定性。,碘的同位素特性表,2 蛋白質、多肽的125I標記技術,蛋白質、多肽碘化的基本反應式 Na125I+氧化劑 125I HO-CH2CH-COOH+125I2-HO-CH2CH-COOH-

3、NH2 NH2 上式表示通過氧化劑使碘化物（125I ）氧化成碘分子（ 125I 2）與蛋白質分子中的酪氨酸殘基發(fā)生碘化作用，所以只要含有酪氨酸的化學物或人工地接上酪氨酸基團的化合物都可用放射性碘標記。蛋白質分子中除含酪氨酸外，還有組氨酸和色氨酸殘基，有時也可生成碘化物，但它們的反應性遠不及酪氨酸，因此影響蛋白質碘化效率的因素，主要取決于蛋白質分子中酪氨酸殘基的數(shù)量及其在分子中的暴露程度，另一方面，碘化物的用量、反應條件（PH、溫度、反應時間等）及氧化劑的性質等也有影響。,3 常用標記方法,(1) 氯胺-T法 (2) 乳過氧化物酶法 (3) 聯(lián)接標記法 (4) 固相氧化法,(1) 氯胺-T法,

4、氯胺-T法具有標記效率高、重復性好、試劑便宜易得、是目前應用最多的標記方法。氯胺-T（Chloramine-T）是一種溫和的氧化劑，它的化學名是 氯代對苯磺酰胺鈉鹽，在水溶液中產生次氯酸，可使碘陰離子氧化成碘分子，反應式如下：,氯胺-T法的標記過程以GH為例,在反應試管中依次加入 GH 50g 50l 125I 2mCi 50l Ch-T 100g 50l 室溫反應1分鐘 SM 200g 100l 1KI 1mg 100l 標記反應完成后用凝膠過濾等方法將125I-GH與游離的125I離子分離。,在標記過程中應注意以下幾個問題：,a.氯胺-T水溶液遇光或暴露至空氣中很不穩(wěn)定，需要在臨用時配制；

5、 b.氯胺-T的用量，按氧化2mCi無載體的Na125I只需要0.15g， 而實際需要量大大超過此值，經驗認為用2mCi新鮮無載體125I時，Ch-T用量約為100g。如用量過大，會明顯降低標記化學物的免疫活性和生物活性，用量不足又降低標記率，甚至標記不上去，此外如碘溶液中含有保護劑（一般用Na2SO3等還原劑），因它需要消耗Ch-T，固用量就需要相應加大。 c.加入Ch-T后必須迅速混勻，以防止標記不均勻，在0240C下，加入Ch-T 后的反應時間一般為一分鐘左右，但也有延長至10分鐘的。 d.加入偏重亞硫酸鈉（SM）終止碘化反應，SM的用量一般為Ch-T量的1.21.5倍就足夠。 e.反應

6、體積要小，使微量的蛋白質保持高濃度，才能保證一定的碘化效率， 含中等量酪氯酸的蛋白質其濃度為300mg/ml時，碘化效率一般為80 90 ， 而如含50mg/ml時，則碘化效率可降至6070 f.PH對碘化效率的影響：碘化反應最適的PH依據(jù)蛋白質的性質而定，一般蛋白質所需的PH為7.37.8，通常Na125I溶液中都含有相當量的NaOH（可高達0.1M），因此所用的緩沖液必須具有足夠的緩沖容量，如常用0.20.5M磷酸鹽緩沖液。,(2) 乳過氧化物酶法,利用乳過氧化物酶（LPO）有促進微量過氧化氫對125I-的氧化作用， 生成125I+并標記在蛋白質酪胺酸分子上。標記方法如下：在反應試管中依次

7、加入： 蛋白質 10g 50l Na 125I 12mCi 50l LPO 20100ng 50l H2O2 80150ng 50l（可分二次加入間隔710分鐘） 室溫下反應1020分鐘 疏基乙醇 10mmol 500l 或PB 0.05M 1ml 終止反應后用凝膠過濾法分離125I -蛋白質與游離125I 。,此法反應的特點是：,a.乳過氧化物酶的用量應少于總蛋白質用量的1，以減少酶自身碘化而帶入放射性雜質， b.過氧化氫應保持低濃度，如濃度高于0.1mM， 則對酶的活性有抑制作用。 c.該法的主要優(yōu)點是反應條件溫和，過氧化氫只需極低濃度（0.01mM），能保持標記化學物原有的生物活和免疫活

8、性。不足之處是標記率較低，一般為2040。,(3) 聯(lián)接標記法,該法是先用Ch-T法將?；瘎?-(對羥基苯)丙酸-N琥珀亞胺脂 Bolton- Hunter試劑）碘化， 然后再用此酰化劑與蛋白質分子中游離氨基酸相縮合而引入蛋白質分子中，,聯(lián)接標記方法,方法如下： 125I-酰化劑 510mol 吹干 蛋白質 510g 50l 緩沖液 PH88.5 100l 水浴反應1530分鐘 加入過量的甘氨酸，使剩余的125I-?；瘎┫牡舳K止反應。,本法的優(yōu)缺點,優(yōu)點是：避免了蛋白質與氧化劑直接接觸，可防止碘源中的有害物質對蛋白質的損傷，適用于標記缺乏酪氨酸的蛋白質或因酪氨酸在蛋白質的活性中心，引入碘

9、原子后會使其失活。 缺點是：操作較麻煩，需要二步反應，125I的利用率較低，不宜標記短肽，只適用于標記分子量大于10000的蛋白質。,(4) 固相氧化法,本法是將氯甘脲（Iodogen）制成固相氧化劑，氯甘脲的化學名為1,3,4,6- 四氯3a,6a-二苯-甘脲。 它與氯胺-T同屬氯酰胺類化合物， 二者使I- 氧化的化學反應本質相同， 但Iodogen在一定的PH及溫度范圍內在水溶液中的溶解度極低， 固可制成固相催化劑，方法是取Iodogen 1mg用二氯甲烷1ml溶解后分裝成50l/管，放置反應試管底部，微微加熱，使溶劑揮發(fā)后，在反應試管底部就形成一層Iodogen薄膜， 蓋上塞子放入有干燥

10、劑的塑料袋中于20c保存，可使用半年。,標記方法如下：,取涂有Iodogen管 1支 0.5M PB PH7.6 100l Mc-Ab 50g 50l 125I 0.5mCi 10l 200C室溫反應15分鐘 0.5M PH7.9 PB 150l終止反應 反應液用Sephadex G-100分離純化，,Iodogen法的特點,Iodogen法是一種簡便、高效、廣譜的碘標記方法，由于Iodogen被固定在試管壁上，與溶液中的標記蛋白質不直接接觸，這就減少了氧化劑對標記物的損傷，使反應更加溫和，簡化了操作步驟，每次標記前無需配制氧化劑溶液，省去了用還原劑終止反應一步，Iodogen法延長了反應時間

11、（15分鐘）， 這樣使反應更容易控制。提高了標記結果的重復性。是一種很有生命力的標記方法。,四 放射性標記物的純化,不論用何種方法制備，要想得到合格的標記化學物，必須將反應物仔細純化，標記化學物在保存過程中也會出現(xiàn)一些不純的物質，同樣需要再次純化，因此要求標記化學物的放化純度大于95%，而且在示蹤過程中要穩(wěn)定。否則所得的示蹤結果不可靠。,1、標記率的測定,標記率是指放射性核素被標記到待標記化學物上的量所占放射性核素總投入量的百分比：即 標記率=標記物的放射性/投入的總放射性X100% 標記率的測定方法 1放射性紙層析； 2薄層層析； 3柱層析； 4蛋白沉淀法,2、標記物的純化,標記化學物的純化

12、方法：色譜法或叫層析法，包括紙層析、薄板層析、柱層析等，柱層析又可分為離子交換法、凝膠過濾法、親和層析法，另外還有透析法、電泳法等等。,標記物分離前后曲線,(1)、紙層析及薄層層析,紙層析是以層析紙作為固定相、以適當?shù)恼归_液作為流動相，當流動相沿著纖維素分子上行時，待測樣品（點在濾紙的下端）也隨之移動，由于樣品中各個組分的性質不同，在固相的吸附能力和在流動相中的溶解度不同，因而各組分隨流動相移動的速度也就不同，也就是說各個組分在固定相上移動的距離不一樣，從而樣品中的各個組分能有效的分開,放射層析,(2)、柱層析法,1 凝膠過濾法 凝膠過濾是利用凝膠把分子大小不同的物質進行分離的一種方法，常用的

13、有葡聚糖凝膠（ Sephadex G ）系列， 分離標記蛋白與游離碘時常用Sephadex G-25或G-50，然后再用G-100進一步純化；這種即有離子交換作用又有凝膠過濾作用，純化效果較好， 2 離子交換法 一般是制成離子交換層析柱，適于分離短肽標記物。 3 親和層析法 利用蛋白質與其特異抗體或受體的結合來分離純化標記蛋白質，此法特異性強，保持生物活性好，但操作較復雜。,使用葡聚糖凝膠凝膠過濾法時的注意事項,a.根據(jù)純化物的分子量適當選用不同型號的葡聚糖凝膠或樹脂葡聚糖凝膠，后者分離效果比前者好； b.粒子粗細的選擇，一般選用中等大小（50150）顆粒， 細顆粒比粗顆粒分離效果好； c.S

14、ephadex G使用前用緩沖液浸泡24小時以上，使之充分膨脹，或在沸水中煮2小時； d.根據(jù)純化要求適當選用層析柱，裝好的凝膠不可有氣泡、斜面及中間斷裂，平衡緩沖液內應加入防腐劑，防止霉菌的生長； e.層析柱使用前要充分平衡，要求平衡液的用量是柱床體積的34倍； f.洗脫時流速不宜太快，每分鐘不超過0.5ml，一般每分鐘在0.20.3ml， 太快可造成分離不純； g.多數(shù)標記多肽或蛋白在上柱分離前，應先用蛋白（如BSA或兔血清等）， 以免標記物吸附于柱上而受損失。,(3)、 透析法,根據(jù)標記物和放射性雜質的分子量的大小不同，選擇孔隙合適的透析袋，將樣品置于透析袋中，并將其懸浮在較大體積的緩沖

15、液中，在攪拌條件下，每6小時更換一次透析液，經過24小時透析作用，較小分子的放射性雜質基本上擴散到透析袋之外，而大分子的標記物則存留在透析袋之內。能將標記蛋白與小分子化學物很好的分離。本法簡便但較費時。,五、標記物的質量鑒定,經純化后的標記化學物，要對其化學、生物學性能、質量進行鑒定，鑒定包括： 1.放射化學純度鑒定； 2.放射性濃度； 3.放射性比活度測定； 4.生物活性和免疫活性測定等 5.其它指標：產品的總放射性活度、放射性濃度、以及測量的時間等。,1 放射化學純度鑒定,放射化學純度（Radiochemical Purity） 放射化學純度（）特定化學形態(tài)的放射性活度/樣品總放射性活度x

16、100% 放射化學純度受制備方法及原料的化學純度、產品存放條件等影響，一般放化純度控制在95以上。 放射化學純度的檢測方法有： a.放射性紙層析和放射性薄層層析； b.放射性高效液相層析； c.凝膠電泳法。,2 放射性濃度,放射性濃度：取1ml產品測其放射性活度，即為放射性濃度，單位為Bq/ml。,3 放射性比活度,放射性比活度（Specific Activity）過去也稱比放射性。 放射性比活度放射性活度/單位化學量,放射性比活度測定方法有：,a.直接測定計算法：將純化后的標記物配成合適的溶液，測量其放射性濃度(Bq/L)及其化學濃度(mmol/L)。放射性比活度=放射性濃度/化學濃度(Bq

17、/mmol) b.估算法：設標記時投入的待標記物的質量為W，投入的放射性核素的總活度為A，標記率(即標記原子的利用率)為Y，那么從理論上講該標記化學物的比活度應=AY/W。 c.自身取代計算法 ：本法是根據(jù)體外竟爭結合的原理，間接地測定標記物的比活度。,自身取代計算法,基本方法： 1.作一條常規(guī)的RIA標準曲線即在一系列試管中加入一定量的標記抗原并加入不同量(由低向高)的非標記抗原和限量抗體進行竟爭性免疫結合反應，然后將結合和游離*Ag分離，分別測量F和B的放射性，以B/F為縱座標，以不同量的非標記抗原為橫座標作標準曲線A； 2.同1，每管加入同量的標記抗原和同量的抗體，但分別再加放不同量的標

18、記抗原，按1同樣的方法分離B、F并分別測量，繪制一條B/F對標記抗原的自身取代曲線B， 3.由于兩條曲線所用的抗體的質量完全相同，在B/F相同的情況下， 曲線A所對應的抗原量和曲線B所對應的標記抗原量的放射性是等效的。,自身取代計算法,4 生物活性與免疫活性,特異結合試驗： a觀察標記物與抗體的結合率，方法是用過量抗體與標記抗原結合。結合率高說明標記物的免疫活性好， b觀察標記抗原與非標記抗原對抗體的親和力。方法是用不同稀釋度的抗體分別與標記抗原及與標記抗原加非標記抗原的混合物進行特異結合，其中混合抗原的總濃度要和單獨使用標記抗原的濃度相同，(如單獨用標記抗原為1.0ng，而混合抗原的總濃度亦為1.0ng，其中標記抗原為0.1ng， 非標記抗原為0.9ng)，比較兩者的結合率，如基本相同說明標記抗原保持了原來親和力，在標記過程中末受到明顯損傷。,免疫活性測定：特異結合試驗,A為標記抗原與抗血清的滴度曲線 B為非標記抗原(加入少量標記抗原)的滴度曲線 C與A相同，但標記抗原免疫活性已有降低,5 影響標記物生物活性、免疫活性及穩(wěn)定性的因素,1 蛋白質、多肽分子上碘原子的參入量，由于將碘原子參入到蛋白質的酪氨酸殘基中去，是非同位素標記，對多數(shù)蛋白質來說，碘化程度對其生物學性質的保持有決定性的影響，每分子中引入的碘原子越少活性的改變也越小。 2