1、抗體工程,抗原的來源,生物組織純化 蛋白的純化方法： 1. 離子交換 2. 凝膠過濾 3. 親和層析 4. 輸水作用層析 等。,抗原的來源,人工合成（化學方法） 1. 半抗原的合成 2. 抗原多肽的合成：多肽合成儀,抗原的來源,蛋白的重組表達 1. 原核細胞的表達方法：大腸桿菌，枯草桿菌。 2. 酵母細胞的真核表達方法：甲醇畢赤酵母的重組表達。 3. 昆蟲細胞的表達： 桿狀病毒表達載體。 4. 哺乳動物細胞的表達： CHO，HEK293。 5. 抗原的單獨表達和融合表達。 6. 表達標簽（TAG）： Fc標簽，HIS標簽，F(xiàn)LAG標簽（DYKDDDDK），C-MYC標簽， GST標簽等。,原核

2、表達系統(tǒng),質(zhì)粒： 1. 多克隆位點（MCS） 2. 抗性基因 3. 啟動子（P） 4. 復制起始位點 （Ori）,原核細胞的表達,操縱子表達模型與啟動子：,酵母真核細胞表達系統(tǒng),酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點： 操作簡便。 表達量高。 培養(yǎng)條件簡單。 易于純化。 N-端可能會有氨基酸缺失。 存在過量糖基化的可能。,昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng),哺乳動物細胞表達系統(tǒng),穩(wěn)定表達細胞系：CHO細胞 瞬時表達細胞系： 293細胞 載體： 原核載體骨架 真核啟動子 增強子 多克隆位點 PolyA信號 真核細胞篩選標志 加壓篩選基因,哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的特點,可以分泌表達，活性高。 純化步驟可能比較復雜。 糖基化比較正常

3、。 成本較高，表達量偏低。 周期較長。 可以建立無血清培養(yǎng)的方法。,第三章 抗體分子的結(jié)構(gòu)和分類,CDR區(qū)：互補決定區(qū) FR區(qū)： 框架區(qū) 重鏈分子量：450-550個氨基酸殘基構(gòu)成，45-70kd 輕鏈分子量：大約214個氨基酸殘基構(gòu)成， 22-24kd,抗體分子片段,抗體分子的分類,IgA和IgM的J鏈，IgA的分泌片 IgG：1,2,3,4.,bacteria,Ab + antigen aggregates are ingested by phagocytic cells,What can antibodies do?,Xenotransplantation, Autoimmuno dis

4、eases,特殊的抗體分子,卵黃抗體IgY：由兩條重鏈（H）和輕鏈（L）組成，重鏈（）由一個可變區(qū)（V）和4個恒定區(qū)（C）組成，沒有鉸鏈結(jié)構(gòu)。完整分子量為180KDa（7.8S），重鏈為 6770KDa，輕鏈為25KDa，但還存在一個小體積副本，120KDa（5.7S），發(fā)現(xiàn)于野鴨和某些龜類中。克隆IgY H鏈表明，較小的IgY H鏈缺乏C3、C4區(qū)，稱為IgY（Fc）,單域抗體,特點： 1. 見于駝類動物，軟骨魚類 2. 沒有輕鏈多肽。 3. CDR3區(qū)較長。 4. 駝類單域抗體沒有CH1. 5. 去除Fc片段后稱為納米抗體。,抗體的生物學功能,特異性的結(jié)合抗原 激活補體 結(jié)合Fc受體 1）

5、調(diào)理吞噬作用：巨噬細胞。 2）介導過敏反應：肥大細胞。 3）ADCC作用：NK細胞、單核細胞。 4）穿過胎盤和粘膜 5）免疫調(diào)節(jié)。,抗體的來源,抗體的定義 抗體的發(fā)現(xiàn)：1888年Emile Roux和Alexander Yersin發(fā)現(xiàn)了白喉毒素，1890年Von Behring發(fā)現(xiàn)，白喉毒素或者破傷風毒素免疫動物后，血液中可以產(chǎn)生阻止毒素誘發(fā)疾病的物質(zhì)，稱為抗毒素（antitoxin)。 電泳分析gamma球蛋白（并不全是抗體） 1972年世界衛(wèi)生組織和國際免疫學聯(lián)合會把具有抗體活性及化學結(jié)構(gòu)與抗體類似的一類球蛋白，統(tǒng)一命名為免疫球蛋白（immunoglobulin)。,人血清球蛋白的電泳圖

6、譜,白蛋白 a1 a2 b g,白蛋白 a1 a2 b g,抗體生成的理論,1897年，Paul Ehrlich提出了側(cè)鏈學說，他認為細胞表面有特異性受體分子，可以釋放的血液里面，就是抗毒素（抗體）。 1930年，Breinl和Haurowitz提出模板學說，認為抗原是抗體合成的模板。 1955年，Jerne提出天然抗體選擇學說，抗原抗體的復合物刺激細胞產(chǎn)生更多針對該抗原的抗體。 1958年，Macfarlane，Burnet，David Talmadge和Joshua提出了克隆選擇學說，每一個產(chǎn)生抗體的細胞克?。˙細胞）只能產(chǎn)生一種抗體，抗原與B細胞表面的膜型抗體分子結(jié)合，刺激B細胞的增殖分

7、化，漿細胞，生產(chǎn)更多的抗體。,Clonal selection theory,細胞凋亡（apoptosis： Caspase） 細胞自噬（autophagy：溶酶體）,人體內(nèi)可以產(chǎn)生10E12以上不同的抗體分子，為什么？,第四章 抗體的基因及其表達,抗體重鏈基因簇（IgH): 14號染色體，1.5Mb 抗體輕鏈Kappa基因簇（IgK）：2號染色體，800kb。 抗體輕鏈Lamda基因簇（IgL）：22號染色體，700kb)。,抗體重鏈的基因及其表達,V基因：51個 J基因： 6個 D基因：27個 C基因：10個,RNA alternative splicing,輕鏈的基因與重排,V基因：30

8、個 J基因：4個 C基因：4個 V基因：40個 J基因：5個 C基因：1個,抗體基因重排的機制,RSS：rearrangement signal sequence 重排信號序列 12/23 規(guī)則 RAG: recombination activating gene RAG1和RAG2異源二聚體 TdT：terminal deoxynucleotidyl transferase 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶,抗體類別的轉(zhuǎn)換,S區(qū)介導的二次重排： switching region，除了Cd外，其它C基因前都有S區(qū)序列。,抗體多樣性的原因,多種不同的基因片段。 不同重鏈和輕鏈的隨機取用和組合。 VDJ基因片

9、段重組時連接的多樣性，連接區(qū)的核苷酸插入。 體細胞的高突變頻率。,抗原與抗體的相互作用,6個CDR區(qū)，非共價結(jié)合抗原，空間可變結(jié)構(gòu)的結(jié)合。 作用特點： 特異性 可逆性 有量效關(guān)系。,抗體的制備,多克隆抗體： 抗血清 血清與血漿 抗體的滴度 單克隆抗體：由單一細胞克隆分泌的，識別同一個抗原決定簇，結(jié)構(gòu)與功能都完全相同的抗體。 基因工程抗體：通過基因工程方法生產(chǎn)或者改造過的抗體分子，一般采用工程細胞進行表達。,免疫血清的制備方法,免疫血清的要求： 效價高，特異性強。 抗原的純度 免疫佐劑 抗原的分類：顆粒型，可溶膠體。 抗原和半抗原： 40kd, 半抗原6000以下。 抗原的純化方法：層析，電泳。

10、,半抗原與載體蛋白的偶聯(lián),常用的載體蛋白： BSA，OVA，KLH 偶聯(lián)機制： 1） 形成酰胺鍵 2）氨基間形成連接橋（NH-R-NH） 3）形成偶氮鍵（-N=N-）：如酪氨酰、組氨酰、賴氨酰殘基間。 4）對于沒有羰基和氨基的半抗原，引入連接基（spacer），再與蛋白偶聯(lián)，甲醛等。,佐劑的使用,氫氧化鋁佐劑（適合人用疫苗） 明礬佐劑 石蠟油、羊毛脂等。 抗原的乳化方法： 1）研磨法 2）注射器乳化法 3）超聲乳化 4）復合乳劑：增加2%的Tween-20生理鹽水，機械或者超聲乳化。,動物的免疫,需要考慮動物種系、抗原劑量、免疫途徑、加強免疫的時間、免疫次數(shù)和佐劑的使用。 用于免疫的動物：兔、

11、大鼠、小鼠、豚鼠、綿羊、山羊、雞、山羊、馬、驢、猴等。 1）抗原與動物種屬的關(guān)系 2）動物的生理狀態(tài) 3）血清的用量 抗原的用量： 兔0.5-1mg/kg體重。小鼠：10-100ug。 免疫途徑：靜脈=脾臟=淋巴結(jié)腹腔肌肉皮下皮內(nèi)。 加強免疫（boost）：每隔2-3周免疫1次，2-3次后，1周后檢測血清中的抗體滴度，然后可以放血，制備抗體。 免疫方案：皮下多點注射。第1次福氏完全佐劑，后面福氏不完全佐劑。,福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑的成分,（福氏完全佐劑的制備：使用前在福氏不完全佐劑中加入適量殺死的分枝桿菌）,抗體在動物血清中的表達水平,多克隆抗體的制備和保存,動物的放血：心臟取血，耳緣靜

12、脈采血（兔），尾尖取血，眼底取血（小鼠，大鼠），頸靜脈取血（大型動物，羊，羊駝）。 處死動物取血的方法：頸動脈取血，摘眼球取血。 血清的分離：冰箱放置過夜，3000rpm,30min, 吸取血清，加入疊氮鈉或者硫柳汞防腐劑，-20或者-80度長期保存。,多克隆抗體的粗提：辛酸飽和硫酸銨沉淀法,將待提取樣品用60mmol/L，pH4.0醋酸緩沖液稀釋34倍，調(diào)pH至4.5，對含脂質(zhì)較高的標本可采用二氧化硅粉或玻璃纖維吸附法除去脂質(zhì)。 在室溫下邊攪拌邊緩慢加入正辛酸，按每ml樣品中加25l，若樣品體積小于5ml，則每ml樣品內(nèi)加入30l正辛酸，攪拌30min。 10 000g離心30min，取上清

13、液通過定性濾紙過濾，裝人透析袋，用20倍體積的PBS，4透析過液，中間換液34次。 然后每毫升混合液加0.27g硫酸銨，攪拌30min。 以5000g離心15min，收集沉淀物，溶于少量PBS中，再以15000g離心20min。上清液即為提取的Ig，其中大部分為IgG，約占90，少量為IgA及IgM，回收率80。整個操作可在24h內(nèi)完成。,DEAE纖維素精制多克隆抗體,蛋白標本對0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4 透析。 DE52裝柱，并以0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4 平衡。 加樣，以0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4 洗脫，紫外監(jiān)測直至洗

14、脫液280nm OD回到基線。這一步驟可除去血清中其他蛋白。 以350ml ，0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4 洗脫，這一步驟可用于純化血清IgG和IgM。 以125ml ，0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4 和125ml 0.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4 梯度洗脫，總量收集250ml；重復步驟（5）。 根據(jù)280nm峰值合并蛋白峰，對PBS透析，PEG濃縮，-20度保存。,蛋白質(zhì)純化系統(tǒng),單克隆抗體的制備,單克隆抗體的定義：序列、結(jié)構(gòu)、功能、抗原結(jié)合性質(zhì)都完全相同的抗體。 來源： 雜交瘤細胞 表面展示抗體文庫 單一B細胞,單克隆抗體來源的圖示,

15、骨髓瘤細胞SP2/0,1.HGPRT基因缺陷 2. TK基因缺陷 3. 不分泌抗體,細胞融合的方法,病毒介導的細胞融合 PEG介導的細胞融合 電融合,HAT培養(yǎng)基在雜交瘤細胞篩選中的作用,HAT選擇培養(yǎng)基的作用是篩選出（雜交瘤細胞）。HAT選擇培養(yǎng)基含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶，其中氨基喋呤可阻斷DNA合成的主要途徑。主要途徑阻斷后，依靠應急途徑即在HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）和TK（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黃嘌呤合成DNA，缺少其中一種，DNA合成不能發(fā)生。用于雜交的骨髓瘤細胞系均由經(jīng)有毒藥物誘導而成選擇產(chǎn)生的代謝缺陷型細胞，細胞內(nèi)均無TK或HGPRT，所以單個或

16、融合骨髓瘤細胞在HAT培養(yǎng)液中將死亡。B細胞雖然有HGPRT和TK，但在體外通常培養(yǎng)條件下，尤其是在單個細胞環(huán)境下難于長期存活和增殖傳代。因此只有雜交瘤細胞才能在HAT培養(yǎng)液中生長繁殖。,單克隆的篩選,液體有限稀釋法（細胞計數(shù)） 半固體培養(yǎng)基法,單克隆抗體的鑒定,ELISA方法的原理： 包被抗原 加入培養(yǎng)基 酶標二抗,小鼠單克隆抗體的制備,雜交瘤細胞的體外培養(yǎng)：RPMI1640培養(yǎng)基 產(chǎn)量較低，條件要求比較嚴格，可以放大。 小鼠腹水的生產(chǎn)方法： 1）腹腔接種降植烷或液體石蠟，每只小鼠0.3-0.5ml。 2）7-10天后腹腔接種用PBS或無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細胞，每只小鼠5105/0.2m

17、l。 3） 間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可用16號針頭采集腹水，一般可連續(xù)采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水； 4）將腹水離心（2000r/min 5分鐘），除去細胞成分和其他的沉淀物，收集上清，測定抗體效價，分裝，-70凍存?zhèn)溆?，或凍干保存?噬菌體抗體庫Surface display antibody library,噬菌體展示庫Phage display library,M13噬菌體的組裝,M13噬菌體抗體展示載體,重鏈和輕鏈在大腸桿菌膜周質(zhì)組裝成Fab,酵母展示技術(shù)Yeast display library,篩選方法： F

18、ACS,核糖體展示文庫Ribosome display library,抗體文庫篩選的優(yōu)缺點,優(yōu)點： 周期短，成本低 缺點： 抗體庫的容量有限，親和力低，需要體外突變以提高抗體的親和力（in vitro maturation) 可能引入新的免疫原性。,單一B細胞篩選的方法,B細胞篩選的優(yōu)缺點,優(yōu)點： 來源于人體，免疫原性最低。 缺點： 來源有限，可能只適用于一些傳染性疾病抗體的篩選，對于自身免疫病和腫瘤相關(guān)的抗原篩選比較困難。,轉(zhuǎn)基因小鼠篩選全人單克隆抗體,小鼠內(nèi)源基因的敲除（knockout）,ES cell,Chimeric mouse,ES cells in medium,Homolog

19、ous recombination,Blastcyst microinjection,抗體的標記技術(shù),同位素標記 酶標記：堿性磷酸酶（AP）、辣根過氧化物酶（HRP）。 熒光素標記：FITC、羅丹明、quantum dot(量子點）、Alexa Flor 488-650nm。 生物素標記： biotin-avidin, strepavidin(鏈親和素） 膠體金標記技術(shù)：氯金酸+檸檬酸還原。,抗體的應用：檢測,RIA EIA ELISA 免疫熒光 免疫組化,EIA 和ELISA：抗原或抗體的檢測,競爭性EIA,膠體金試紙條：定性檢測,電化學發(fā)光檢測（ECILA）,是利用電化學發(fā)光劑標記的抗原或

20、抗體與待測物經(jīng)過一系列的免疫反應和洗滌等理化步驟，最后用光學儀器測量免疫反應前后電化學發(fā)光信號強度的改變，從而對抗原或抗體物質(zhì)進行定量分析的一種方法。,當反應體系中加入電子供體三丙胺后，在電場作用下，釕分子和三丙胺在電極表面分別被氧化成三價釕和帶陽離子的自由基三丙胺。后者很不穩(wěn)定，迅速失去一個質(zhì)子形成強還原劑自由基三丙胺，將三價釕分子還原成激發(fā)態(tài)的二價釕，其自身則被氧化成二丙胺和丙醛。接著激發(fā)態(tài)的釕分子 衰減成基態(tài)釕分子，同時放出一個波長為的光子。這一過程在電極表面以每毫秒幾十萬次的速度循環(huán)進行，產(chǎn)生的光子經(jīng)光電倍增管檢測光強度，從而測出待檢抗體或抗原的含量。,免疫-PCR,PCR 免疫檢測方

21、法,噬菌體免疫PCR,組織切片與免疫組化（熒光）,冷凍切片,石蠟切片 1.取材 2.固定 3.水洗 4.脫水包埋 5.切片 6.展片 7.撈片 8.鋪片 9.染色 10. 封片 11.觀察,FACS：florescence activated cell sorting,MACS: magnetic activated cell sorting,蛋白質(zhì)芯片的原理與檢測,1. 二抗檢測：顯色、熒光或發(fā)光。 2. 質(zhì)譜檢測,不同水平的基因表達調(diào)控,microRNA,Alternative splicing,Histone acetylation and methylation,DNA methyla

22、tion,1.Phosphorylation 2.Glycolysation 3.ubiquitination,免疫共沉淀：Co-IP,Ch-IP：染色體免疫共沉淀,Western blot,抗體藥物：治療領(lǐng)域,傳染性疾病：埃博拉病毒 自身免疫性疾?。侯愶L濕性關(guān)節(jié)炎 腫瘤：乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌 作用機理：1.ADCC作用殺死腫瘤細胞 2.CDC作用 3.阻斷腫瘤細胞內(nèi)的血管新生 4.阻斷腫瘤生長的信號通路 5.解除腫瘤細胞對免疫系統(tǒng)的抑制作用 代謝性疾?。汗琴|(zhì)疏松、糖尿病。,抗病毒作用,自身免疫性疾病,腫瘤的治療：ADCC作用,腫瘤治療：CDC效應,腫瘤的血管新生,腫瘤自分泌生長因子,腫瘤的免

23、疫檢查點,代謝性疾病的治療,抗體藥物的研發(fā),選擇疾病類型 選擇相關(guān)的抗原 選擇研發(fā)的方向：仿制藥？創(chuàng)新藥？ 選擇抗體的來源：鼠源、人源。 選擇抗體的表達方式：酵母？CHO？轉(zhuǎn)基因植物？藻類細胞？人源細胞？ 選擇生產(chǎn)的工藝：不銹鋼？一次性袋子？ 選擇細胞培養(yǎng)的工藝：灌流？流加？,發(fā)酵罐,WAVE,細胞培養(yǎng)的方式,灌流,流加,抗體的純化,抗體仿制藥的研發(fā),文獻的調(diào)研：化合物專利、純化專利、制劑專利、組合物專利等。 原研藥的鑒定：氨基酸序列，原研藥的采購。,蛋白質(zhì)的N-端測序,Edman化學降解，其基本原理是包括通過異硫氰酸苯脂與蛋白質(zhì)和多肽的N-端殘基的偶聯(lián)，苯氨基硫甲酰酞（PTC-肽）環(huán)化裂解，

24、和噻唑呤酮苯氨（ATZ）轉(zhuǎn)化為苯異硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）三個主要的化學步驟，每個循環(huán)從蛋白質(zhì)與多肽裂解一個氨基酸殘基，同時暴露出新的游離的氨基酸進行下一個Edman降解，最后通過轉(zhuǎn)移的PTH-氨基酸鑒定實現(xiàn)蛋白質(zhì)序列的測定。,高表達細胞株的構(gòu)建：cell pool,高表達細胞株的構(gòu)建：單克隆的篩選,抗體編碼DNA序列的優(yōu)化原則,GC含量 密碼子使用偏性 隨機性 RNA的二級結(jié)構(gòu) 終止密碼子的選擇（雙終止密碼子） DNA的人工合成與序列分析,人基因組DNA的GC含量：40%,抗體分子DNA序列的優(yōu)化：密碼子偏性,抗體DNA序列的優(yōu)化：RNA二級結(jié)構(gòu),表達載體的構(gòu)建,GCCACCATGG,K

25、ozak translation initiation sequence,信號肽的選擇,抗體的分泌步驟,CHO細胞的DNA轉(zhuǎn)染,1. 陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,2. 電轉(zhuǎn)法,CHO細胞培養(yǎng),CD培養(yǎng)基的主要成分,The constituents of a chemically defined media include: a basal media (such as DMEM, F12, or RPMI 1640, containing amino acids, vitamins, inorganic salts, buffers, antioxidants and energy sources)

26、, which is supplemented with recombinant albumin, chemically defined lipids, recombinant insulin and/or zinc, recombinant transferrin or iron, selenium and an antioxidant thiol such as 2-mercaptoethanol or 1-thioglycerol.,氨基酸,氨基酸 氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基

27、酸。其中谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。因此，各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應置于-20冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4冰箱中儲存2周以上時，還應重新加入原來量的谷氨酰胺。,碳水化合物和無機鹽,碳水化合物 碳水化合物是細胞生長主要能量來源，其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。 無機鹽 培養(yǎng)液中無機鹽的主要功能是幫助細胞維持滲透壓平衡。此外，通過提供鈉，鉀和鈣離子，幫助細胞調(diào)節(jié)細胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個非常重要的因素,細胞通?？赡?/p>

28、受260mOsm/kg320mOsm/kg。標準培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動。特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強酸或強堿中的物質(zhì)。向培養(yǎng)液中添加HEPES時需調(diào)節(jié)鈉離子濃度。,緩沖系統(tǒng)和維生素,緩沖系統(tǒng) 大多數(shù)細胞所需pH在7.2-7.4。但是，細胞培養(yǎng)最適pH值隨培養(yǎng)的細胞種類不同而不同。成纖維細胞喜歡較高pH（7.4-7.7），而傳代轉(zhuǎn)化細胞系則需要偏酸pH（7.0-7.4）。由于多數(shù)培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉（NaHCO3）與CO2體系進行緩沖，因此，氣相中的CO2濃度應與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度相平衡。如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中CO2濃度設定在5，培養(yǎng)液中NaH

29、CO3的加入量為1.97g/L；如果CO2濃度維持在10，培養(yǎng)液中NaHCO3的加入量為3.95g/L。細胞培養(yǎng)瓶蓋不應擰得太緊，以保證氣體交換。 HEPES是一種非離子緩沖液，在pH7.2-7.4范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力，但是非常昂貴，在高濃度時對一些細胞可能有毒。HEPES緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L）共用，以抵消因額外加入HEPES引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細胞培養(yǎng)瓶的蓋子應擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作為pH指示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，堿性培養(yǎng)液呈深紅色。 維生素 在細胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來源，但是許多培養(yǎng)基中添

30、加了各種維生素以適合更多的細胞系生長。,CHO細胞的培養(yǎng)工藝優(yōu)化,培養(yǎng)工藝的放大,溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、PH、溶氧、泡沫和液面水平。,培養(yǎng)工藝優(yōu)化和放大的DOE軟件,培養(yǎng)基成分的優(yōu)化,氨基酸成分分析,全自動生化分析儀,培養(yǎng)基的澄清過濾,碟片式離心機,(1)進料，(2)排出口（輕相），(3)向心泵，(4)碟片，(5)儲渣空間，(6)排渣口，(7)排渣活塞閥，(8)離心捕集器，(9)排出口（重相），(10)噴嘴，(11)計量注水/開啟水，(12)定時器,在離心工藝開發(fā)過程中，有很多參數(shù)需要優(yōu)化，如補料的速度、離心機轉(zhuǎn)速、濾餅層的去除頻率等，這些參數(shù)會影響到細胞的穩(wěn)定性、處理的時間以及抗體收率等?？捎猛ㄟ^

31、優(yōu)化這些參數(shù)合理地使各種訴求達到平衡。,切向流過濾,切向流過濾是指液體流動方向與過濾方向呈垂直方向的過濾形式。傳統(tǒng)的液體死端過濾(dead end)是大部分微孔過濾(MF，微濾)，包括除菌過濾所采用的過濾形式，其液體的流動方向與過濾方向一致，隨著過濾的進行，過濾膜表面形成的濾餅層或凝膠層厚度逐漸增大，流速逐漸降低。只能處理小體積的料液。對于較大規(guī)模的料液過濾時，就需要采用切向流過濾方式，液體流動在過濾介質(zhì)表面產(chǎn)生剪切力，減小了濾餅層或凝膠層的堆積，保證了穩(wěn)定的過濾速度。,切向流微濾系統(tǒng)主要應用于生物工程領(lǐng)域下游處理，如取代離心機從發(fā)酵液中收集細胞及去除細胞碎片等，特別是賽多利斯的切向流MF系統(tǒng)

32、因其能夠整體在位蒸汽滅菌，還可以應用于動物細胞連續(xù)培養(yǎng)的無菌換液以及提高菌體分泌物表達收率，在培養(yǎng)過程中無菌條件下的連續(xù)換液。,抗體的純化,蛋白A親和層析 陰離子交換樹脂 陽離子交換樹脂 除菌過濾 去病毒：低pH值，納濾。 抗體原液,抗體的質(zhì)量分析,Protein Concentration -70.9 mg/mL 63.0 -77.0 Potency - 100% 80 -125% ID (immunoassay) - Pass SE-HLC - MP: 99.8 %, HMW: 0.2 %, LMW: 0.0% MP 99 % CE-SDS,reduced -HC+LC: 98.9 %,

33、HC: 66.8 % LC: 32.1 % LC+HC 98% CEX-HPLC - MP: 89.6 %, Acidic: 2.7 %, Basic: 7.7 % 80% CEX-HPLC ID - Pass Osmolality - 314 mOsm/kg 300 50 pH - 5.2 at 24.6C 5.0 5.4 Appearance - Report Volume - 1.2 mL (average 1.1525 mL, n = 5) 1 mL Sub-visible Particulate - 29 particles/container 10 m no more than 6

34、000 particles/container 25 m no more than 600 Sterility - Pass Bacterial Endotoxin - 0.2 EU/mL 5.0 CHOP ELISA - 4.4 ppm Protein-A ELISA - 0.5 ppm,抗體的糖基化檢測,利用毛細管電泳和質(zhì)譜 (CEMS) 對重組單克隆抗體 (mAb) 糖基化進行分析。 此方法包括利用 N-糖苷酶 F (PNGase F) 酶解 mAb 得到多糖，對多糖進行熒光標記（ 8-氨基吡-1,3,6-三磺酸三鈉鹽，ATPS），并利用 CE 串聯(lián) 精確質(zhì)量 Q-TOF LC/MS 進

35、行分析。,抗體糖基化的MS檢測結(jié)果,抗體質(zhì)量分析相關(guān)的指導原則,1-cde人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導原則20032-EP7monoclonal antibody for human use3-ICH Q6B測試方法和接受標準：生物技術(shù)和生物 藥品4-FDAAssay Development for Immunogenicity Testing of Therapeutic Proteins5-FDAPoints to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use,抗

36、體的生物學活性檢測,分子水平的活性鑒定 細胞水平的活性鑒定 動物水平的活性鑒定：誘導、移植、基因修飾。 阻斷活性 殺傷腫瘤細胞活性：自發(fā)瘤、腫瘤細胞株、移植瘤。 激活免疫細胞活性：原代培養(yǎng)的免疫細胞、白血病細胞株（THP-1、Jurkat細胞等）,實驗動物疾病模型,抗體的制劑研究,凍干制劑 液體制劑 高濃度液體制劑,抗體制劑的輔料,藥用輔料是指在制劑處方設計時，為解決制劑的成型性、有效性、穩(wěn)定性、安全性加入處方中除主藥以外的一切藥用物料的統(tǒng)稱。藥物制劑處方設計過程實質(zhì)是依據(jù)藥物特性與劑型要求，篩選與應用藥用輔料的過程。藥用輔料是藥物制劑的基礎(chǔ)材料和重要組成部分，是保證藥物制劑生產(chǎn)和發(fā)展的物質(zhì)基

37、礎(chǔ)，在制劑劑型和生產(chǎn)中起著關(guān)鍵的作用。它不僅賦予藥物一定劑型。而且與提高藥物的療效、降低不良反應有很大的關(guān)系，其質(zhì)量可靠性和多樣性是保證劑型和制劑先進性的基礎(chǔ)。輔料在制劑中作用分類有66種。,抗體制劑的輔料,海藻糖或蔗糖（凍干保護） 磷酸鹽或者檸檬酸鹽緩沖系統(tǒng) Tween-20（助溶） 組氨酸（保護劑） 冷鏈運輸?shù)膯栴},抗體制劑的穩(wěn)定性分析,Protein Concentration -70.9 mg/mL 63.0 -77.0 Potency - 100% 80 -125%: molecular and cell levelsSE-HLC - MP: 99.8 %, HMW: 0.2 %,

38、LMW: 0.0% MP 99 % CE-SDS,reduced -HC+LC: 98.9 %, HC: 66.8 % LC: 32.1 % LC+HC 98% CEX-HPLC - MP: 89.6 %, Acidic: 2.7 %, Basic: 7.7 % 80%Osmolality - 314 mOsm/kg 300 50 pH - Glycolyzation Appearance - Report Volume - 1.2 mL (average 1.1525 mL, n = 5) 1 mL Sub-visible Particulate - 29 particles/contain

39、er 10 m no more than 6000 particles/container 25 m no more than 600 Sterility - Pass Bacterial Endotoxin - 0.2 EU/mL 5.0aggregation Container and stopper Accelerative stability test Long term stability test Impurity test,抗體的免疫治療方法概覽,免疫脂質(zhì)體,雙功能抗體和多功能抗體,Antibody drug conjugation(ADC),第一代ADC：隨機偶聯(lián) 第二代ADC

40、：定位整合 Ambrx公司：稀有氨基酸摻入 Redwood Biosciences: 延長多肽鏈，偶聯(lián)藥物 半胱氨酸偶聯(lián),腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤,Probody技術(shù),抗EGFR抗體治療的副作用,CAR-T治療急性淋巴細胞白血病,CAR-T的定義,Artificial T cell receptors (also known as chimeric T cell receptors, chimeric immunoreceptors, chimeric antigen receptors (CARs) are engineered receptors, which graft an arbitrary

41、 specificity onto an immune effector cell. Typically, these receptors are used to graft the specificity of a monoclonal antibody onto a T cell; with transfer of their coding sequence facilitated by retroviral vectors or lenti virus vectors. The receptors are called chimeric because they are composed

42、 of parts from different sources.,CAR-T的技術(shù)原理,CAR-T治療技術(shù)的發(fā)展,CAR-T治療的臨床研究,ALL（treated with alfaCD19-CD3zeta CARs-modified T cells) B cell lymphoma (treated with alfaCD20-CD3zeta CARs-modified T cell) neuroblastoma patients (treated with ScFv-CD3zeta CARs-modified T cell),CAR-T治療的優(yōu)缺點,HLA-independent rec

43、ognition of antigen, broad applicability for many patients and the rapid delivery of CAR-modified T cells. Successful application of these modified T cells will require the identification of the tumor-associated antigen, that are expressed only on tumor cells, thereby minimizing the risk of toxicity

44、。 significant release of pro-inflammatory cytokines, pulmonary toxicity, multi-organ failure and eventual death of the patient. So called “cytokine storm” 。 unlike antibodies against tumor-associated antigens, these cells are not cleared from the body quickly,抗體藥物的臨床申報 ：臨床前研究,i. 臨床前研究。1.藥物靶點的確認。這個是所

45、有工作的開始。只有確定了靶點，后續(xù)所有的工作才有展開的依據(jù)。2.化合物的合成。這個階段的工作主要負責新化合物的合成，現(xiàn)有化合物的結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化，或者抗體的篩選。3.活性化合物的篩選不是所有合成出來的化合物或者抗體都能有理想的活性，在這個階段需要通過生物實驗手段篩選出初步有活性的化合物用作備選。這些化合物叫先導化合物（lead）。得到的活性數(shù)據(jù)可以結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)得到初步的構(gòu)效關(guān)系分析。構(gòu)效關(guān)系可以有效的指導后續(xù)的化合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化。這一步工作主要在細胞實驗層面展開。 4. 評估藥物的藥理作用，安全性與毒性，藥物的吸收、分布、代謝和排泄情況（ADME）。 這部分的實驗需要在動物層面展開。細胞實驗的結(jié)果

46、和活體動物實驗的結(jié)果有時候會有很 大的差異。這一步的目的是確定藥物的有效性與安全性（GLP中心）。 5.制劑的開發(fā)：制劑后藥物的吸收、分布、代謝和排泄情況，制劑的穩(wěn)定性試驗，分析數(shù)據(jù)。 6. 連續(xù)三批生產(chǎn)的藥品，申報文件的準備。,抗體藥物的申報：I期臨床試驗,在新藥開發(fā)過程中,將新藥第一次用于人體以研究新藥的性質(zhì)的試驗,稱之為期臨床試驗.即在嚴格控制的條件下,給少量試驗藥物于少數(shù)經(jīng)過謹慎選擇和篩選出的健康志愿者(對腫瘤藥物而言通常為腫瘤病人),然后仔細監(jiān)測藥物的血液濃度排泄性質(zhì)和任何有益反應或不良作用,以評價藥物在人體內(nèi)的性質(zhì).期臨床試驗通常要求健康志愿者住院以進行24小時的密切監(jiān)護.隨著對新藥的安全性了解的增加,給藥的劑量可逐漸提高,并可以多劑量給藥.通過期臨床試驗,還可以得到一些藥物最高和最低劑量的信息,以便確定將來在病人身上使用的合適劑量.可見,期臨床試驗是初步的臨床藥理學及人體安全性評價試驗,目的在于觀測人體對新藥的耐受程度和藥代動力學,為制定給藥方案提供依據(jù).,抗體藥物的申報：II期臨床試驗,通過期臨床研究,在健康人身上得到了為達到合理的血藥濃度所需要的藥品的劑理的信息,即藥代動