1、第一章 轉(zhuǎn)化外源基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控,第一節(jié) 轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá) 第二節(jié) DNA序列對轉(zhuǎn)化外源基因表達(dá)的調(diào)控 第三節(jié) DNA甲基化對轉(zhuǎn)化外源基因表達(dá)的調(diào)控 第四節(jié) 提高轉(zhuǎn)化外源基因表達(dá)的策略,第一節(jié) 轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá),一、轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時(shí)表達(dá) 在合適的條件下，轉(zhuǎn)化的外源基因通常在數(shù)小時(shí)后就能檢測到其表達(dá)的產(chǎn)物，并在1-2天內(nèi)達(dá)到最高值，隨后又逐漸降低，至十多天后完全消失。這種短時(shí)間內(nèi)的外源基因表達(dá)稱之為瞬時(shí)表達(dá)。,1.外源基因瞬時(shí)表達(dá)的機(jī)制,（1）瞬時(shí)表達(dá)是未整合的外源基因的表達(dá) （2）瞬時(shí)表達(dá)是一種正常的表達(dá)方式 基因擴(kuò)增是指細(xì)胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專

2、一性地大量增加的現(xiàn)象。擴(kuò)增的基因片斷游離在細(xì)胞核內(nèi)。,2.外源基因瞬時(shí)表達(dá)的影響因素,（1）質(zhì)粒DNA的基因結(jié)構(gòu)； （2）細(xì)胞內(nèi)源核酸酶的影響； （3）受體細(xì)胞生理狀態(tài)及其內(nèi)源Gus酶抑 制劑的影響；,3.外源基因瞬時(shí)表達(dá)的應(yīng)用,（1）在基因轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力的檢測； 優(yōu)化基因轉(zhuǎn)化條件，選擇導(dǎo)入DNA的方法，確定農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的時(shí)間等。 （2）植物基因表達(dá)調(diào)控的研究 啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、終止子的功能研究； 外界因素對基因表達(dá)調(diào)控的影響； 植物激素的調(diào)控機(jī)理。,二、轉(zhuǎn)化外源基因的穩(wěn)定表達(dá),所謂穩(wěn)定表達(dá)是指外源基因整合到和基因組DNA分子上，并能穩(wěn)定地遺傳的外源基因的表達(dá)。需符合以

3、下條件： （1）表達(dá)時(shí)間長，無迅速衰退現(xiàn)象； （2）DNA已整合到植物基因組中； （3）能夠傳遞給后代，并符合分離規(guī)律。,第二節(jié) DNA序列對轉(zhuǎn)化外源基因表達(dá)的調(diào)控,一、植物基因工程中常用的啟動(dòng)子 按作用方式及功能不同可將啟動(dòng)子分為三類： 組成型啟動(dòng)子 2. 組織特異性啟動(dòng)子 3. 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,1. 組成型啟動(dòng)子,在該類型啟動(dòng)子控制下，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)大體恒定在一定水平上，在不同組織部為表達(dá)水平也沒有明顯差異，為此稱之為非特異性表達(dá)組成型啟動(dòng)子。其特點(diǎn)是：表達(dá)具持續(xù)性；表達(dá)量相對穩(wěn)定；不表現(xiàn)時(shí)空特異性；不受外界因素誘導(dǎo)；在結(jié)構(gòu)上存在六聚體花紋序列（TGACTG），往往以重復(fù)形式出現(xiàn)并被6-8個(gè)

4、核苷酸隔開。,（1）CaMV35S啟動(dòng)子,該啟動(dòng)子來自花椰菜花葉病毒（CaMV），其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的沉降系數(shù)為35S，故名。 最近發(fā)現(xiàn)35S啟動(dòng)子可以劃分為兩個(gè)區(qū)域：從-90 +8為A區(qū)域，主要負(fù)責(zé)在胚根、胚乳的根及根組織內(nèi)表達(dá)；從-343 -90為B區(qū)域，主要負(fù)責(zé)在胚的子葉及成熟植株的葉組織及維管組織內(nèi)表達(dá)，在B區(qū)域內(nèi)的增強(qiáng)子序列可以提高表達(dá)水平。,（2）Nos和Oct啟動(dòng)子,來自與根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的胭脂堿合成酶基因和章魚堿合成酶基因，具有與植物基因相似的序列。,2. 組織特異性啟動(dòng)子,也稱為器官特異性啟動(dòng)子，在這類啟動(dòng)子的調(diào)控下，基因的表達(dá)往往只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位，并往往表現(xiàn)出發(fā)育

5、調(diào)節(jié)的特性。這種特異性通常以特定的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)物理信號為存在的基礎(chǔ)。典型的組織特異性啟動(dòng)子有：馬鈴薯塊莖蛋白基因啟動(dòng)子；小麥胚乳特異表達(dá)的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因啟動(dòng)子；番茄果實(shí)成熟特異性表達(dá)的多聚半乳糖醛酸酶基因啟動(dòng)子；花粉特異表達(dá)基因（lat52）啟動(dòng)子和木質(zhì)部特異表達(dá)的苯丙氨酸脂肪酶基因（pal）啟動(dòng)子等。,3. 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,所謂誘導(dǎo)型啟動(dòng)子就是在某些特定的物理或化學(xué)信號的刺激下，可以大幅度地提高基因轉(zhuǎn)錄水平的啟動(dòng)子。該類啟動(dòng)子常以誘導(dǎo)信號命名，如光誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子；熱誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子；創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子；真菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子等。,二、終止子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,不同來源

6、的有著很大影響。使用35S啟動(dòng)子與NPTII結(jié)構(gòu)基因形成共整合體，并于不同來源的終止子構(gòu)建成融合基因，轉(zhuǎn)化煙草。發(fā)現(xiàn)不同的終止子使NPTII基因的表達(dá)水平可相差60倍。植物基因的終止密碼子多用UGA，而在雙子葉植物中，UAA的使用頻率高于UGA。,三、5，3端序列對外源基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用,基因的整體表達(dá)過程包括：轉(zhuǎn)錄、初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工、運(yùn)輸、mRNA的翻譯以及蛋白產(chǎn)物的后加工這一系列步驟，每個(gè)步驟上都存在著復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)節(jié)，只提高外源基因的轉(zhuǎn)錄活性并不能有效地提高細(xì)胞中相應(yīng)的mRNA 水水平和蛋白含量。分析和改造轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、提高mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯活性是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究的重點(diǎn)。,1.

7、 5 端帽序列的調(diào)控,帽子結(jié)構(gòu)不僅能提高翻譯起始頻率，還能保護(hù)mRNA 免遭外且核酸酶的破壞，提高mRNA的穩(wěn)定性。,2. 5 端先導(dǎo)序列的調(diào)控,從真核基因mRNA 5 端帽子到起始密碼子之間的不翻譯核苷酸序列稱為先導(dǎo)序列。先導(dǎo)序列的結(jié)構(gòu)、組成和長度對翻譯效率的影響是存在的，但不是絕對的。TMV基因組RNA68堿基的先導(dǎo)序列和AMV RNA436堿基的先導(dǎo)序列具有提高外源基因mRNA 翻譯活性的功能。,3.poly(A)及其信號序列的調(diào)控,poly(A)和某些蛋白因子的結(jié)合能保護(hù)mRNA 免遭外切核酸酶的降解。 3端聚腺苷酸信號附近的一些核苷酸序列能夠促進(jìn)提高植物基因表達(dá)水平，很可能是通過促進(jìn)

8、mRNA加工和增加其穩(wěn)定性而發(fā)揮作用。,四、內(nèi)含子對轉(zhuǎn)化外源基因的表達(dá)調(diào)控作用,1.內(nèi)含子有利于基因的變異進(jìn)化 （1）有利于在內(nèi)含子序列之間發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的基因； （2）內(nèi)含子切割點(diǎn)的變異導(dǎo)致外顯子延伸。 2.內(nèi)含子具有提高外源基因表達(dá)水平的作用 由于內(nèi)含子的有效拼接提高了細(xì)胞中成熟mRNA 的水平，從而有利于基因表達(dá)。,五、信號肽序列對轉(zhuǎn)化外源基 因翻譯產(chǎn)物的調(diào)控作用,翻譯的完成不是基因表達(dá)的結(jié)束，初級翻譯產(chǎn)物并不具有生物活性，稱之為前體蛋白。它通常還需要加工、修飾和正確折疊才能成為有活性的蛋白。前體蛋白的信號肽與活性蛋白的成熟有關(guān)、也與蛋白質(zhì)的運(yùn)輸和分泌有關(guān)。,第三節(jié) 甲基化對轉(zhuǎn)化外

9、源基因的表達(dá)調(diào)控,DNA甲基化現(xiàn)象廣泛地存在于動(dòng)植物細(xì)胞中，有許多重要的生物學(xué)功能，包括DNA復(fù)制起始、突變、修飾限制系統(tǒng)等。通過改變DNA的甲基化狀態(tài)可以調(diào)控基因的表達(dá)。,1. DNA甲基化的作用機(jī)制,（1）甲基化影響DNA與蛋白質(zhì)的相互識別與作用； （2）甲基化影響DNA的構(gòu)象，從而調(diào)節(jié)DNA的基因活性。 如以5-氮胞嘧啶核苷取代胞苷，誘導(dǎo)消除甲基化修飾，可使基因激活。,2. DNA甲基化在轉(zhuǎn)基因植物中的作用,眾多實(shí)驗(yàn)表明， DNA甲基化嚴(yán)重影響外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平。,第四節(jié) 提高轉(zhuǎn)化外源基因表達(dá)的策略,一、克服轉(zhuǎn)化外源基因失活的策略 1.篩選單拷貝轉(zhuǎn)基因株系； 2.核基質(zhì)附著

10、區(qū)的使用； 3.誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子的使用； 4.基因DNA序列的改造。 二、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、內(nèi)含子、5和3 端調(diào)控序列的使用 三、優(yōu)化先導(dǎo)序列，提高翻譯效率,第二章 外源基因整合的鑒定,為獲得真正的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行基 因轉(zhuǎn)化后要進(jìn)行以下工作： 第一步：篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞； 第二步：對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，Southern、Northern、Western。 第三步：性狀鑒定； 第四步：遺傳學(xué)分析，獲得轉(zhuǎn)基因品種。,第一節(jié) Southern雜交,Southern雜交用于檢測和分析外源基因的整合情況。用標(biāo)記的外源基因（或片斷 ）做探針，與植物細(xì)胞染色體DNA進(jìn)行雜交。具體的檢測方法有Sout

11、hern斑點(diǎn)雜交和Southern印跡雜交兩種。下面以Southern印跡雜交為例加以介紹。,一、植物總DNA提取,1.植物總DNA提取提取原理及方法概述 2.植物總DNA提取的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 3.植物DNA樣品純度及濃度的檢測 4.植物DNA樣品的保存,1.植物總DNA提取原理及方法概述,（1）CTAB法 原理：CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度（ 0.3mol/L NaCl ）時(shí)，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開。然后將CTAB與

12、核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀， CTAB能溶于乙醇。,方法： 1.取1-50克新鮮植物材料，于液氮中研磨成粉。 2.將凍粉轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，立即加入等體積（w/v） 65 預(yù)熱的2 x CTAB提取緩沖液，充分混勻， 65 保溫10-20分鐘，其間不時(shí)搖動(dòng)。 3.加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒離心管混勻， 室溫下12000rpm離心10-20分鐘。 4.將上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，假如1/10體積的10% CTAB，混勻，加入等體積的氯仿/異戊醇，顛倒離心 管混勻，室溫下12000rpm離心10-20分鐘。 5.取上相，重復(fù)4操作一次。,6.將上相轉(zhuǎn)入新的離心管，加入

13、1-1.5倍體積的1x CTAB沉淀緩沖液，混勻，室溫下放置30分鐘，沉淀。 7.3500-4000rpm離心5-10分鐘，去上清 ，沉淀吹干。 8.按0.5ml/g材料的比例加入1mol/L乙酸銨溶液，使沉淀溶解完全，再加入7.5mol/L乙酸銨至終濃度為2.5mol/L. 9.加入2倍體積的異戊醇，混勻，室溫下放置10分鐘。 10. 10000rpm離心5分鐘，去上清。 11.用70%乙醇漂洗沉淀，吹干，沉淀溶于適量TE。 優(yōu)點(diǎn)： 能很好的去除糖類雜質(zhì)，對于含糖較高的材 料可優(yōu)先采用。,（2）SDS法,原理： 利用高濃度的SDS，在較高溫度（55-65 ）條 件下裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋

14、白質(zhì)變性，釋放出 核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白 質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀（最常用的是加入5mol/L 的KAC于 冰上保溫，低溫條件下KAC 與蛋白質(zhì)及多糖結(jié)合成不 溶物），離心除去沉淀后，上清中的DNA反復(fù)用酚/氯 仿抽提，用乙醇沉淀水相中的DNA。,（3）植物總DNA提取時(shí)常遇到的問題,1.植物材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，使DNA呈褐色。 解決辦法：提高CTAB提取緩沖液中巰基乙醇的含量 或在SDS提取液中加入6%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。 2.植物細(xì)胞壁難以破碎。 解決辦法：在SDS提取液中加入蛋白酶K，在液氮冷 凍條件下研磨。,2.植物DNA樣品純度及濃度的鑒定,用于Sou

15、thern雜交的植物DNA樣品在純度、長度及濃度上均有較高的要求。純度上應(yīng)無蛋白質(zhì)、RNA、多糖及抑制限制性內(nèi)切酶活性的物質(zhì)；在長度上不應(yīng)低于50kb；濃度應(yīng)在0.5-1 g/ l之間。目前主要采用瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法進(jìn)行檢測。,（1）瓊脂糖凝膠電泳,1.所提植物DNA應(yīng)呈現(xiàn)出一條分子量較大的清晰條帶。如樣品呈彌散狀，說明DNA已嚴(yán)重降解，可能原因是：所用的器皿及試劑是否滅菌；材料收集后是否立即冷凍，研碎過程中或研碎后進(jìn)入提取液前是否融化；是否有劇烈振動(dòng)、吸管口過窄、產(chǎn)生起泡、反復(fù)吹打等操作。 2.如在溴酚蘭處出現(xiàn)明亮的熒光區(qū)，說明RNA過多，可用RNA酶消化。 3.如在樣品槽內(nèi)有熒

16、光出現(xiàn)，說明DNA為完全溶解或濃度過高，或樣品不純。 4.估算樣品的濃度。,（）紫外分光光度法測定,1.純度： 純凈的DNA溶液其OD260OD280應(yīng)為1.8， OD260OD230應(yīng)大于2.0。 如果OD260OD280大于1.8，表明應(yīng)中含有較多的RNA；如果OD260OD280小于1.6，則說明樣品中蛋白質(zhì)較多； OD260OD230小于2.0時(shí)，表明溶液中有殘存的小分子及鹽類雜質(zhì)，可增加70%乙醇洗滌沉淀的次數(shù)。 2.濃度： DNA樣品濃度（ g/ l ）= OD260稀釋倍數(shù)0.05,二、雜交探針的制備,探針是指經(jīng)特殊化和物標(biāo)記的特定的核苷酸序列。用于檢測植物基因組中外源基因整合的

17、探針應(yīng)為同源探針，一般長度在300bp以上。 雜交探針的制備包括探針核苷酸序列的獲取和標(biāo)記兩部分內(nèi)容。,1.探針核苷酸序列的獲取,（1）人工合成； （2）從質(zhì)粒上切?。ㄙ|(zhì)粒DNA的制備 質(zhì)粒DNA 樣品純度及濃度的檢測 質(zhì)粒DNA的酶切 探針片斷的回收）。,2.探針標(biāo)記,（1）標(biāo)記物 理想的標(biāo)記物應(yīng)滿足以下條件： 1.標(biāo)記前后探針的基本結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相同； 2.檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好且操作簡便、節(jié)時(shí)； 3.穩(wěn)定、安全、無環(huán)境污染； 4.經(jīng)濟(jì)。,表一、標(biāo)記物類別,（2）標(biāo)記方法 1.切口平移法 2.隨機(jī)引物法 3.末端標(biāo)記法 4.化學(xué)標(biāo)記法,1.切口平移法,利用微量的DNA酶I使待

18、標(biāo)記的雙鏈DNA分子產(chǎn)生若干單鏈缺口，然后E.coliDNA聚合酶I的5 3外切作用在切口的5端將脫氧核苷酸逐個(gè)切下，同時(shí)該酶的3 5聚合或性誘使反應(yīng)體系中的核苷酸底物按模板要求依次連接到切口的3羥基處。,2.隨機(jī)引物法,隨機(jī)引物法是近幾年來興起的一種有效的標(biāo)記方法，在反應(yīng)體系中加入寡核苷酸引物，模板DNA變性成單鏈后與寡核苷酸引物雜交，形成局部的雙鏈區(qū)，DNA聚合酶以引物的3-OH為起始點(diǎn)，按照模板的順序形成互補(bǔ)的探針。 該方法有如下優(yōu)點(diǎn)：要求模板純度不是很高；反應(yīng)比較穩(wěn)定；標(biāo)記的探針比活性高；可在低溶點(diǎn)瓊脂糖中反應(yīng)。,3.末端標(biāo)記法,5末端標(biāo)記常用T4多聚核苷酸激酶，標(biāo)記物常用-32PATP。 3末端標(biāo)記常用末端轉(zhuǎn)移酶，該酶催化-32PdNTP加到3末端。,4.化學(xué)標(biāo)記法,酶法是先將標(biāo)記物標(biāo)記在核苷酸上，然后再通過酶促聚合反應(yīng)使帶標(biāo)記的核苷酸摻入到核酸序列中。 化學(xué)法是通過標(biāo)記物的活性基團(tuán)與核酸分子中的某個(gè)基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而進(jìn)行標(biāo)記。 酶法目前使用較多，但標(biāo)記程序復(fù)雜，費(fèi)用高；化學(xué)法的主要問題是試劑及操作因標(biāo)記物不同而不同，沒有一個(gè)常規(guī)的方法。,三、Southern印跡雜交,1. Southern印跡雜交原理 2. South