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文檔簡介

1、陽性克隆的快速檢測,一、實驗目的 學習藍白斑篩選試驗中陽性克隆的快速檢測方法 掌握藍白斑篩選的原理和方法,二、藍白斑篩選的原理,重組質粒轉化細菌后，藍白斑篩選往往是基于抗生素篩選基礎上的第二次篩選。 一般培養(yǎng)轉化細菌的培養(yǎng)基中都要加入一定濃度的適宜抗生素，只有含有質粒載體的細菌才可以生長形成菌落，即抗生素完成對細菌是否含有質粒載體進行了初步篩選。 質粒載體上存在的LacZ基因片段當被外源DNA片段插入時，會產(chǎn)生白色的克隆，不含插入片段的質粒進入宿主細胞生成藍色菌落。這就是藍白斑篩選，即a-互補顯色反應,lacZ,-半乳糖苷酶,分解乳糖,i,P,O,調(diào)控蛋白P,大腸桿菌的-半乳糖苷酶基因lacZ

2、系統(tǒng),a-互補顯色反應（藍白斑篩選）,lacZ -,-半乳糖苷酶-,分解乳糖,i,P,O,調(diào)控蛋白P,-半乳糖苷酶基因lacZ突變體M15,三、實驗材料、器具及藥品,實驗器具1.5ml Ep管，離心管架，微量取液器，臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床，電泳儀，紫外透射檢測儀。,實驗材料 LB固體培養(yǎng)基上生長的藍白菌斑,實驗藥品 1. 溶液 0.4mol/L NaOH 2%SDS 臨用前1:1混合貯存液即為II液.,2. 分離液 酚/氯仿/異戊醇25:24:1,3. 1%瓊脂糖凝膠,四、實驗步驟,分別挑取多個白色菌斑和一個藍色對照菌斑到1.5ml含有80g/ml Kan抗生素的LB 液體培養(yǎng)基 37搖培過夜（1012h） 6000rpm, 3min 棄去上清液，倒立于濾紙之上，盡量去凈上清。 短暫離心，收集剩余上清，彈勻至沒有明顯菌塊 加50l II液，充分混勻 加100l 酚-氯仿-異戊醇，渦旋振蕩，使溶液

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