1、治療侏儒癥的唯一方法：向患者注射生長激素。,加拿大袖珍女童肯娜迪(4歲，66厘米高)就像父親手中的“玩具洋娃娃”。,現(xiàn)在利用基因工程方法：將人的生長激素基因?qū)氪竽c桿菌中，使其生產(chǎn)生長激素。人們從 450 L大腸桿菌培養(yǎng)液中提取的生長激素，相當于6萬具尸體的全部產(chǎn)量。,450L大腸桿菌培養(yǎng)液提取的生長激素相當于6萬具尸體的全部產(chǎn)量,第十四章 基因工程及常見分子生物學技術(shù),第一節(jié) 重組DNA技術(shù),DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone,一、重組DNA技術(shù)相關概念,（一） DNA克隆（DNA

2、 cloning）,是指應用酶學的方法將目的基因和載體重組，再導入受體細胞內(nèi)進行擴增和表達的過程，也稱重組DNA技術(shù)或基因克隆。,基因工程(genetic engineering) 實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學。,（二）工具酶,限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶,重組DNA技術(shù)中常用的工具酶,限制性內(nèi)切酶,(restriction endonuclease),定義:是一類能識別DNA的特異序列, 并在識 別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。,型限制酶識別序列特點回文結(jié)構(gòu),一般識別雙鏈D

3、NA的48個核苷酸順序，其中以6個核苷酸順序最為常見。,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,（三）目的基因(target gene),定義： 指基因工程研究中，感興趣的基因或DNA。 例如：,控制智商的基因,控制胖瘦的基因,1.定 義：是攜帶目的DNA片段進入受體細胞進行擴增 和表達的工具。,2.分 類： (1)克隆載體: 使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體。 (2)表達載體: 使插入的外源DNA序列轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈的載體。,（四）基因載體,質(zhì)粒 (plasmid),特點,存在于細菌等細胞質(zhì)中 雙鏈環(huán)狀DNA分子 大約 1-200 Kb 具有自主復制和轉(zhuǎn)錄能力 不能獨立

4、存活 在子細胞中保持恒定的 拷貝數(shù)并表達其遺傳信息,常用載體：細菌質(zhì)粒、噬菌體、黏粒、病毒、酵母人工染色體、細菌人工染色體等,特點： 多克隆位點 篩選標記,二、重組DNA技術(shù)基本原理,基本原理,以 質(zhì) 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過 程,1. 化學合成法 2.基因組DNA文庫(genomic DNA library) 3. cDNA文庫(cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應(PCR),（一）目的基因的獲取,化學合成法獲取目的基因,由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。,已知目的基因核苷酸序列或其產(chǎn)物氨基酸序列,基因組DNA文庫,cDNA文庫,粘性末端連接,（三）外源基因與載體

5、的連接,（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建,目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和構(gòu)建方法也不同。,Bam H切割反應,T4 DNA連接酶 15C,重組體,載體自連,目的基因自連,2. 平端連接 適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 粘端補齊或切平形成的平端,轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導的區(qū)別,（四）重組DNA導入宿主細胞,Bam H切割反應,T4 DNA連接酶 15C,重組體,載體自連,目的基因自連,1. 直接選擇法 (1) 抗藥性標記選擇 (2) 標志補救 (3) 分子雜交法 原位雜交 Southern印跡 2. 免疫學方法 如免疫化學方法及酶免檢測分析等,（五）重組體的篩選,(插入失活法) 抗藥性標記選擇

6、,重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為,小 結(jié),重組DNA技術(shù)操作的主要步驟,克隆載體和表達載體的比較,（六）克隆基因的表達,常用分子生物學技術(shù)的原理及應用 The Common Used Techniques in Molecular Biology,第二節(jié),一、分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization and Blotting Technique,核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization) 在DNA復性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關系，就可以在

7、不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex) 。,（一）分子雜交與印跡技術(shù)的原理,復性,RNA,DNA,1、印跡技術(shù),利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。,用放射性核素、生物素或熒光染料標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。,2、探針技術(shù),NC膜,DNA或RNA,探針,（二）印跡技術(shù)的類別及應用,1、DNA印跡 (Southern Blotting),2、RNA印跡 (Northern Blotting),3、蛋白質(zhì)的印跡 (Western Blottin

8、g),用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。,用于RNA的定性定量分析。,用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。,二、聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction, PCR),末代沙皇尼古拉II 1918年的流行性感冒病毒 電影侏羅紀公園 辛普森殺妻案,（一）PCR 的故事,上述四件事情到底有什么相關呢？,然而近二十幾年來生物技術(shù)的一項新發(fā)明，把它們給連在一塊了。這項技術(shù)就是“聚合酶鏈反應”（polymerase chain reaction，PCR）,答案是NO!,PCR最大的特點是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案

9、中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。,PCR的發(fā)明人，一般公認是穆里斯（K. Mullis），他因此獲得了1993年的諾貝爾化學獎。,Kary Banks Mullis,the Pacific Coast Highway,PCR的點子，據(jù)穆里斯的說法，那是在1983年春天的一個周五晚上，他開車帶著女友前往鄉(xiāng)間的小屋度周末。在蜿蜒的鄉(xiāng)間公路上開著車，一段DNA反復復制的景像，在他的腦海里冒了出來。穆里斯原以為這樣簡單的想法，應該有人提出過，但搜索文獻后卻發(fā)現(xiàn)沒有。,變性 95 C,延伸 72 C,退火 Tm-

10、5 C,1. PCR的基本反應步驟,（二）PCR技術(shù)的工作原理及應用,模板DNA 特異性引物 耐熱DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,2.PCR體系基本組成成分,黃石公園的熱泉,1973年臺灣科學家錢嘉韻從黃石公園熱泉里一種嗜熱菌中成功分離出耐高溫的Taq DNA聚合酶。,Thermus aquaticus,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,3. PCR技術(shù)的工作原理,4. PCR技術(shù)的主要用途,生命學科 醫(yī)學工程 遺傳工程 疾病診斷 法醫(yī)學 考古學,核酸序列分析的基本原理：,化學裂解法 (Maxam-Gillbert法),DNA鏈的末端合成終止法

11、(Sanger法),三、核酸序列分析 Nucleic Acid Sequence Analysis,DNA鏈末端合成終止法,四、遺傳修飾動物模型的建立及應用 The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model,轉(zhuǎn)基因技術(shù),多利誕生過程,核轉(zhuǎn)移技術(shù),第三節(jié) 重組DNA技術(shù)與醫(yī)學的關系,The application of Gene engineering in Medicine,一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆,疾病基因發(fā)現(xiàn)的兩個典型例子:,脆性X綜合征,Kallwann綜合征,根據(jù)基因定位克隆該基因并研究其性質(zhì)，而認識

12、疾病的分子機制。,治療侏儒癥的唯一方法，是向人體注射生長激素。而生長激素的獲得很困難。以前，要獲得生長激素，需解剖尸體，從大腦的底部摘取垂體，并從中提取生長激素。 現(xiàn)可利用基因工程方法，將人的生長激素基因?qū)氪竽c桿菌中，使其生產(chǎn)生長激素。人們從 450 L大腸桿菌培養(yǎng)液中提取的生長激素，相當于6萬具尸體的全部產(chǎn)量。,二、生物制藥,例：生長激素的制備,MstII酶切位點,5,5,3,突變基因,1.15Kb 0.20Kb,1.35Kb,正?；?三、基因診斷與治療,（一）基因診斷,利用分子生物學和分子遺傳學的技術(shù)方法通過直接檢測基因結(jié)構(gòu)是否改變、基因表達有否異常，對疾病作出診斷。,鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析,3,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突變攜帶著,患者,鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析,（二）基因治療,將外源正常基因?qū)氚屑毎?，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病以達到治療的目的。,第一例基因治療腺苷脫氨酶缺乏癥,患者生存在無菌環(huán)境中,ADA基因+ 載體（逆轉(zhuǎn)錄病毒） 重組DNA分子 導入