1、無機抗菌材料抗菌性能試驗方法 編制說明一、任務來源本標準方法的制定工作，是根據(jù)國家出入境檢驗檢疫局下達的制標任務，計劃編號2008B034，由遼寧出入境檢驗檢疫局提出起草研究。二、編制依據(jù)本標準方法是根據(jù) GB/T1.1-2000 標準化工作導則第一部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則的要求進行編寫的。無機抗菌材料抗菌性能試驗方法是參考國內(nèi)外有關(guān)文獻，經(jīng)研究、改進和大量的驗證后而制定的。經(jīng)檢索查新，國際標準尚無無機抗菌材料抗菌性能試驗方法的標準，國內(nèi)尚無相應的國家標準和行業(yè)標準。三、方法概述 國內(nèi)外研制了各類無機抗菌材料，這些材料具有優(yōu)異的抗菌性能。但該類材料的抗菌性能檢測在國內(nèi)尚無統(tǒng)一標準，目前大多參

2、照國外的行業(yè)標準，因而檢測結(jié)果不具有權(quán)威性。日本抗菌制品技術(shù)協(xié)會SIAA(Society of Industrial-technology for Antimicrobial Articles )1995年推出并于1998年修訂了抗菌制品的抗菌力評價試驗法薄膜密著法。該標準于2000年12月編入國家工業(yè)標準JIS Z 2801-2000抗菌加工制品抗菌性試驗方法和抗菌效果。在國內(nèi)，2001年由中國建筑材料科學院負責制定了抗菌建材產(chǎn)品第一個行業(yè)標準抗菌陶瓷制品抗菌性能(JC/T 897-2002),2002年輕工業(yè)部制定了抗菌塑料抗菌性能試驗方法和抗菌效果 ( QB/T2591 -2003)行業(yè)

3、標準,2003年中國建筑材料科學院負責制定了抗菌建材產(chǎn)品第二個行業(yè)標準建筑用抗細菌塑料管抗細菌性能，2008年中國石油和化學工業(yè)協(xié)會負責制定了GB/T 21866-2008 抗菌涂料抗菌性測定法和抗菌效果。但是，目前我國尚沒有針對無機抗菌材料抗菌性能檢測的系統(tǒng)、完整的國家標準和行業(yè)標準。鑒于目前國內(nèi)外尚未見系統(tǒng)、完整的國家標準或行業(yè)標準方法，迫切需要建立無機抗菌材料抗菌性能檢測的標準檢驗方法。本標準方法參照國內(nèi)外有關(guān)文獻，以大腸桿菌、金黃葡萄球菌及肺炎克雷伯氏菌等為試驗菌株，研究材料的廣譜抗菌性能。粉體材料抗菌性能采用瓊脂稀釋法，薄膜材料的抗菌性能采用薄膜密貼法測定。經(jīng)過大量試驗研究，在系統(tǒng)研

4、究無機抗菌材料在不同環(huán)境下的抗菌性能以及材料的穩(wěn)定性能、安全性能的基礎(chǔ)上，建立通用的無機抗菌材料的分析檢測方法。四、主要研究內(nèi)容本標準借鑒國外兩種抗菌檢測標準的方法及條件，選取了幾種適合粉體型及薄膜型光催化抗菌材料的方法進行定性和定量測試，并對其實用性及操作性進行比較，最終制定了最佳的抗菌性能檢測方法。4.1 抑菌圈法該法適用于編織物和粉體抗菌性能的定性評價。將制備的粉體用模具在高壓下壓制成直徑為2 cm的圓形樣品進行抗菌實驗。于無菌培養(yǎng)皿中加入已滅菌的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，使之覆蓋整個培養(yǎng)皿底部，再均勻涂上一定量濃度的大腸桿菌菌液，形成菌液膜，將樣品放于培養(yǎng)皿中央。于37 下培養(yǎng)48 h ，

5、觀察抗菌劑周圍的細菌生長情況，測量抑菌圈的大小。具體實驗步驟如下:(1) 依次準確稱取3 g牛肉膏、10 g蛋白凍、5 gNaCl、15 g20 g瓊脂放入燒杯中。在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃棒攪勻，然后在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。將藥品完全溶解后，補充水到1 L。在未調(diào)節(jié)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸性，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入l mol/LNaOH溶液，邊加溶液邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH，直至pH達到7.6。反之，用l mol/L HCl進行調(diào)節(jié)。(2) 按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入錐形瓶和試管內(nèi)。培養(yǎng)基分裝完畢后，在錐形瓶口和試管口塞上棉塞，

6、以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。加塞后，將全部錐形瓶和試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。(3) 將上述培養(yǎng)基以0.103 MPa，121 ，20 min高壓蒸汽滅菌。將滅菌的試管培養(yǎng)基冷卻至50 左右，將試管口端擱在試管架上，擱置的斜面長度不超過試管總長的一半為宜。將滅菌培養(yǎng)基放入37 的溫室中培養(yǎng)24 h，以檢查滅菌是否徹底。制得斜面培養(yǎng)基若干，供接種培養(yǎng)細菌備用。(4) 將細菌接種在斜面培養(yǎng)基上，在37 下培養(yǎng)16-24 h后轉(zhuǎn)接一次，在37下培養(yǎng)16-20 h。

7、(5) 將培養(yǎng)皿、試管、鑷子、玻璃杯、玻璃棒、移液管等經(jīng)清洗后放入電熱恒溫干燥箱烘干殺菌，在160下滅菌2 h。(6) 依次取無菌磷酸鹽緩沖液10 mL放入滅菌的試管中，在斜面培養(yǎng)基上取一環(huán)菌放入第一個試管中混勻后取出1 mL放入第二個試管，此時菌液濃度為10-2，如此反復進行，使菌液濃度稀釋至10-6。(7) 取1 mL10-6菌液滴入到已滅菌的平皿中，取冷卻至50左右的營養(yǎng)瓊脂20 mL左右倒入平皿中并與菌液混勻。(8) 待營養(yǎng)瓊脂凝固后，取壓制成形的抗菌樣品放入平板中央（以不破壞瓊脂平板為宜），把培養(yǎng)基放入紫外燈下光照1 h，培養(yǎng)基和紫外燈的距離大約20 cm。(9) 將光照后的培養(yǎng)基放

8、入37生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈大小，按互成45的4個直徑方向測量透明抑菌圈直徑，計算平均值。4.2 自然菌落計數(shù)法以各類文獻和標準為基礎(chǔ)，綜合了定量測試的一些方法，經(jīng)過反復摸索，設(shè)計了以下自然菌落計數(shù)法：(1) 配置磷酸鹽緩沖液(PBS)，成分是磷酸氫二鈉2.83 g，磷酸二氫鉀1.36 g，蒸餾水1000 mL，使用濃度為0.03mol/L，依次準確稱取3 g牛肉膏、10 g蛋白凍、5 gNaCl、15 g20g瓊脂溶解，將上述培養(yǎng)基于121，20 min高壓蒸汽滅菌；(2) 將細菌接種在平板培養(yǎng)基上，在37下培養(yǎng)16-24 h后取單一菌落轉(zhuǎn)接于10 mL營養(yǎng)肉湯中，在37下

9、培養(yǎng)16-20 h。然后用滅菌后的PBS液做倍比稀釋，使細菌濃度為10-5 cfu/mL；(3) 稱取一定量的粉體型光催化抗菌材料于上述滅菌后的培養(yǎng)基中，配制成相應的粉末濃度(0 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，30 mg/L，40 mg/L和50 mg/L)，充分振蕩培養(yǎng)基，使粉體與菌液接觸均勻，然后倒15-20 mL合培養(yǎng)基于平皿中；(4) 將培養(yǎng)皿放置在光源下直接照射1 h，在37下培養(yǎng)24 h，采用菌落計數(shù)法確定樣液中的菌含量。與空白(不加抗菌劑)對比樣的活菌數(shù)的比值即求得的殺菌率。4.3 懸浮液抗菌法為了使菌液與粉體能夠充分接觸，我們在抗菌測試的過程應用磁力攪拌器使菌液與粉

10、體形成懸浮液后邊攪拌邊光照，具體步驟如下：(1) 稱取一定量的二氧化鈦粉體溶于配制好的100 mL生理鹽水中，密封后以0.103 MPa，121，20 min高壓蒸汽滅菌。(2) 將培養(yǎng)皿、試管、鑷子、玻璃杯、玻璃棒、移液管等經(jīng)清洗后放入電熱恒溫干燥箱烘干殺菌，在160下滅菌2 h。(3) 將細菌接種在平板培養(yǎng)基上，在37下培養(yǎng)16-24 h后取單一菌落轉(zhuǎn)接于10 mL營養(yǎng)肉湯中，在37下培養(yǎng)16-20 h。(4) 依次取無菌生理鹽水9 mL放入滅菌的試管中，在培養(yǎng)后的營養(yǎng)肉湯中取出1 mL放入第一個試管中，吹吸數(shù)次混勻后取出1 mL放入第二個試管，此時菌液濃度為10-2，如此反復進行，使菌液

11、濃度稀釋至10-5。(5) 取1 mL10-5菌液滴入到含有粉體的生理鹽水中，放在磁力攪拌器上使其形成懸浮液后打開日光燈光照1 h，取無粉的生理鹽水中接種的菌液濃度為初如對照組。(6) 光照后取1 mL菌液于已滅菌的平皿中，取冷卻至50左右的營養(yǎng)瓊脂20 mL左右倒入平皿中并與菌液混勻后放入37生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。(7) 利用菌落計數(shù)法考查殺菌率4.4 總結(jié)本實驗所選取的定性測試及定量測試方法的可操作性存在一些差異，對粉體的抗菌效果也有一定影響，相對而言，懸浮液抗菌法操作簡便，粉體與菌液接觸充分，現(xiàn)將以上三種方法的優(yōu)缺點總結(jié)于表1。表1 抗菌測試方法對比Table 1 the con

12、trast of the antimicrobial test method檢測方法測試性質(zhì)優(yōu)點缺點抗菌效果抑菌圈法定性(1) 光源與抗菌材料直接接觸(2) 抑菌效果直觀抗菌效果低時無抑菌圈無抑菌圈自然菌落計數(shù)法定量(1) 操作過程簡單(2) 粉體與菌液接觸不夠充分(1) 培養(yǎng)基溫度不易控制(2) 光源與抗菌材料接觸不充分(3) 活菌數(shù)計數(shù)不夠直觀30%左右懸浮液抗菌法定量(1) 操作過程簡單(2) 光催化過程直觀(3) 磁力攪拌使粉體與菌液混合均勻(4) 活菌數(shù)計數(shù)直觀50%左右五、主要研究成果試驗結(jié)果表明，經(jīng)24 h48 h細菌培養(yǎng)后, 所有含菌濃度的測試樣品都能在營養(yǎng)瓊脂中生長，并得到單菌落，說明該抗菌檢測方法的敏感性可達到10 cfu/mL103 cfu/mL。最佳制備條件下粉體的殺菌率為54.90%，薄膜型光催化抗菌材料的殺菌率為90.46%。六、室間驗證情況項目承擔單位委托：吉林出入境檢驗檢疫局、天津出入境檢驗檢疫局、河北出入境檢驗檢疫局、遼寧省分析科學研究院、遼寧省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院等家單位進行了驗證工作。驗證結(jié)果表明，本項目的檢測方法，完全能夠滿足無機抗菌材料抗菌性能的快速檢測。參考文獻1 華金銘，劉平. 無機抗菌材料抗菌性能粉末抑菌圈法測定影響因素J. 玻璃與搪瓷，2006，34(3)：5-8.2曾冬冬