1、PCR法獲取目的基因,農(nóng)學(xué)112班 馬晴晴 孫婷婷 張 娜 金漪倩 胡 斐 徐振鵬,PCR技術(shù)的定義及其發(fā)展歷史 PCR技術(shù)的原理 PCR的反應(yīng)體系和條件 PCR法獲取目的基因 PCR技術(shù)的未來展望,PCR技術(shù) 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction),PCR技術(shù)即多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法。 在生物學(xué)實驗中做為基礎(chǔ)存在，可以說是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中最重要的技術(shù)。,一、PCR技術(shù)的創(chuàng)建,1.Khorana等1971年提出在體外經(jīng)DNA變性、 與適當(dāng)引物雜交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。 2.1983年,M

2、ullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。 3.1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)。 4.1988年，第一臺PCR儀問世。 5.1989年美國Science雜志比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。,二、 PCR技術(shù)的原理,1. PCR技術(shù),在微量離心管中,加入適量的緩沖液, 微量的模板DNA,四種脫氧核苷酸,耐熱性DNA聚合酶, 一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段的循環(huán)合成DNA，每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍。一般樣品經(jīng)過30次循環(huán),可使基因的拷貝數(shù)達(dá)到數(shù)百萬。,PCR

3、原理 （1）類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于寡核苷酸引物的存在 （3）重復(fù)“變性-退火-延伸”的循環(huán)，可獲得大量的新DNA鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板，從而指數(shù)級地獲得大量DNA產(chǎn)物，數(shù)小時內(nèi)可使目的基因的數(shù)量擴增數(shù)百萬倍。,（2）PCR過程：由變性復(fù)性（退火）-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成 變性：94左右，使雙鏈DNA模板解離成為單鏈； 復(fù)性：55左右，引物與模板DNA單鏈互補配對結(jié)合； 延伸：72左右，“模板-引物結(jié)合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，以靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成新的DNA鏈,2. PCR技術(shù)的特點,1）速度快，靈敏度高：經(jīng)過3

4、0輪循環(huán)，理論上目的產(chǎn)物的 擴增量達(dá)230個拷貝（109拷貝）。 2）特異性：引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵；引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性，同時盡可能減少非特異性擴增。 3）操作簡便易行：只需要數(shù)小時就可以用電泳法檢出1g基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。,三、PCR的反應(yīng)體系和基本步驟,H2O 35L 10PCR反應(yīng)緩沖液 5L 25mmol/L MgCl2 4L 4種dNTP 4L 上游引物（引物） 0.5L 下游引物（引物） 0.5L 模板DNA (約1ng) 0.5L Taq酶 0.5L,1 .反應(yīng)體系組成成分（總體積：50 L）,

5、模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+,預(yù)變性,模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+,TaqDNA聚合酶,94 5min,2. 基本程序,PCR排管,Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+,循環(huán)儀,94 55 72 ,72 57 min,循環(huán)2535次,擴增出的目標(biāo)基因,轉(zhuǎn)移點樣 進行電泳,擴增出的目的基因,3. PCR反應(yīng)條件 循環(huán)參數(shù) （1）預(yù)變性：94 5 min （2）變性：94 20 s-45 s 使雙鏈DNA解鏈為單鏈 （3）退火：溫度由引物的解鏈溫度Tm決定，時間45 s左右。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合；降低溫度 可

6、增加反應(yīng)的靈敏性。 （4）延伸：一般為72，時間由擴增片段長度決定。 （5）循環(huán)次數(shù)：主要取決于模板DNA的濃度，一般為25-35次 次數(shù)過多，導(dǎo)致擴增效率降低，錯誤摻入 率增加。到達(dá)平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)。 （6）延伸補齊：72 5 min10 min,PCR技術(shù)的注意事項,1.合理分隔實驗室將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其他步驟嚴(yán)格分開。 2.吸樣槍由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性

7、完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。 3.試劑分裝所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，-20保存，以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機會。另外，PCR試劑和PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存。 4.防止操作人員污染一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。,四、PCR法獲取目的基因,由Taq DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物中，其3末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為Taq DNA聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時可以使用T載體克隆目的基因。,1. T載體克隆PCR獲取的目的基因,具有3-5 外切酶活性的DNA 聚合酶（如pfu聚合

8、酶），其擴增的PCR 產(chǎn)物是平末端, 要對這種平末端的PCR 產(chǎn)物進行克隆, 應(yīng)首先對PCR產(chǎn)物的3末端進行加A的工作。工作程序如下,方案一 膠回收平末端 PCR產(chǎn)物，進入5l 10Tag DNA Polymerase Buffer、4種dNTP或dATP（終濃度為200nM）、2.5U Tag DNA Polymerase，加水至終反應(yīng)體積為 50l，72 保溫10min，純化 PCR片段后進行TA克隆,方案二 PCR 反應(yīng)（50l 反應(yīng)體積）結(jié)束以后，加入1l 20mM dATP 和2.5U 的Tag 酶，72 保溫10min ，然后進行直接進行TA克隆,2 .設(shè)計酶切位點克隆PCR獲取的

9、目的基因,3,5,限制性內(nèi)切酶的識別序列,目的基因的PCR片段,3,5,限制性內(nèi)切酶的識別序列,經(jīng)限制酶切割得到的具有粘性末端的線性載體,經(jīng)限制酶切割得到粘性末端,體外連接,獲得目的基因的克隆,1 、不對稱PCR 2 、反向PCR (reverse PCR) 3 、多重PCR（復(fù)合PCR） 4、 LP-PCR（Labelled primers) 5 、錨定PCR（anchored PCR, A-PCR） 6 、PCR固相分析法 7 、原位PCR 8 、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR) 9、 熒光定量 PCR（real-time PCR),五、PCR的類型,熒光定位PCR技術(shù)（FQ-PCR）,FQ-

10、PCR的工作原理是利用Taq 酶的5 3外切酶活性，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個熒光標(biāo)記的探針。該探針可與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交，探針的5端標(biāo)以熒光報告基團，靠近3端標(biāo)以熒光淬滅基團，兩者之間構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。,當(dāng)PCR反應(yīng)每復(fù)制一個特異核酸片段，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數(shù)目和PCR產(chǎn)物是一對一的關(guān)系，因此用熒光檢測技術(shù)檢測,出的熒光信號有無或強弱，即代表擴增產(chǎn)物有無或多少。由于熒光信號是代表擴增產(chǎn)物的有效特異信號,實現(xiàn)了儀器實時檢測，為新的PCR定量原理創(chuàng)造了條件。,PCR技術(shù)的應(yīng)用舉例：,研究：基因克隆；DNA測序；分析突變；基因重組與融合；鑒定與調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié) 合DNA序列；轉(zhuǎn)座子插入位點的繪圖；檢測基因的修飾；人類基因組工程：用散布重復(fù)序列產(chǎn)生DNA標(biāo)志；遺傳圖譜的構(gòu)建(檢測DNA、 多態(tài)性或精子繪圖)；物理圖譜的構(gòu)建；測序，表達(dá)圖譜 法醫(yī)：犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析，DNA檢測比對，DNA安保標(biāo)記。 醫(yī)療：腫瘤：胰癌、結(jié)腸癌、肺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、血液惡性腫瘤等癌癥的篩查。 組織和群體生物學(xué)：遺傳聚類研究；動物保護研究。 古生物學(xué)：考古與博物館標(biāo)本分析。 動物學(xué)：動物傳染病的診斷等。 植