1、基因工程的基本步驟,1,基因操作的基本步驟,2,基 因 工 程 的 基 本 過 程,3,基因操作的基本步驟,1）獲得目的基因（目的基因的獲取 ） 2）制備重組DNA分子（基因表達(dá)載體的構(gòu)建 ） 3）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞（將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞） 4）篩選重組細(xì)胞 5）實(shí)現(xiàn)功能表達(dá),目的基因的檢測和表達(dá),4,目前被較廣泛提取使用的目的基因有： 蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。,將需要的基因從供體生物的細(xì)胞內(nèi)提取出來。,(一）獲得目的基因,5,目的基因的提取方法,直接分離基因 人工合成基因,反轉(zhuǎn)錄法 根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA,：鳥槍法,6,1）鳥槍法

2、：,供體細(xì)胞中的DNA,許多DNA片段,運(yùn)載體,限制酶,與載體連接 載入,受體細(xì)胞,產(chǎn)生特定性狀,導(dǎo)入,外源DNA擴(kuò)增,目的基因,分離,(散彈射擊法、直接分離法),7,用DNA重組技術(shù)將某種生物的總DNA用特定的限制性內(nèi)切酶切割成一個(gè)個(gè)片段，然后將這些片段隨機(jī)地連接在某些質(zhì)粒或其他載體上，再將它們轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，通過細(xì)胞的增殖而構(gòu)成各個(gè)片段的無性繁殖系（克?。?dāng)這些克隆多到可以包括某種生物的全部基因時(shí)，這一批克隆的總體就稱為該種生物的基因文庫。,8,9,基因組DNA文庫,cDNA文庫,基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較,10,以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈D

3、NA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,目的基因的mRNA,單鏈DNA(cDNA),雙鏈DNA (即目的基因),反轉(zhuǎn)錄,合成,2）反轉(zhuǎn)錄法：,11,3）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,推測,推測,目的基因,化學(xué)合成,12,上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？,操作簡便廣泛使用,工作量大，盲目，分離出來的有時(shí)并非一個(gè)基因,專一性強(qiáng),操作過程麻煩，

4、mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高,專一性最強(qiáng),僅限于合成核苷酸對(duì)較少的簡單基因,13,哪些新技術(shù)能大大簡化基因工程的操作技術(shù)？,1）DNA序列自動(dòng)測序儀： 2）PCR技術(shù)：,對(duì)提取出來的基因進(jìn)行核苷酸序列分析。,使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增。,14,PCR 可以把 指定的基因片段 數(shù)量放大,染色體,PCR 基因放大連瑣反應(yīng),聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR),15,2）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即PCR技術(shù),16,（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建,17,基因表達(dá)載體的組成：,目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)

5、和發(fā)揮作用。,a、目的基因,b、啟動(dòng)子,c、終止子,d、標(biāo)記基因,e、復(fù)制原點(diǎn),18,啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì),結(jié)構(gòu)基 因,RNA聚合酶,半乳糖苷酶,酶,酶,啟動(dòng)子,RNA聚合酶,19,終止子：位于基因的尾端的一段特殊 的DNA片斷，能終止mRNA的 轉(zhuǎn)錄,標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞 中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來,20,目的基因,限制性內(nèi)切酶,T4 DNA連接酶 15C,重組體,目的基因 自連,基因組,21,（三）目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,常用的受體細(xì)胞：,有大腸桿菌

6、、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。,轉(zhuǎn)化 ,目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),22,方法,將目的基因?qū)?植物細(xì)胞,將目的基因?qū)?動(dòng)物細(xì)胞,將目的基因?qū)?微生物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細(xì)胞,23,1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 （1）農(nóng)桿菌介紹 （2）原理及適用范圍,24,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 （1）方法：顯微注射法 （2）程序：,25,2.微生物作受體細(xì)胞原因：,將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,3.轉(zhuǎn)化方法：,大腸桿菌,繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少,處理細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)載體與感受

7、態(tài)細(xì)胞混合 _細(xì)胞吸收DNA分子。,Ca2+,感受態(tài),感受態(tài),1.常用菌：,26,（四）目的基因的檢測和表達(dá),初選,27,再次檢測,檢測,鑒定,檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因,檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法,方法,方法,DNA分子雜交,分子雜交,抗原抗體雜交,28,29,不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達(dá)。,受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達(dá)嗎？,若不能表達(dá)，要對(duì)抗蟲基因再進(jìn)行修飾。,30,多細(xì)胞生物的檢測，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個(gè)體，檢測這些個(gè)體

8、是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無變化的個(gè)體，保留有相應(yīng)變化的個(gè)體進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。,例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。,31,從蘇云金芽苞桿菌中提取抗蟲基因,從土壤農(nóng)桿菌中提取帶有選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒,同一種限制酶處理,抗蟲基因與質(zhì)粒結(jié)合形成重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入土壤農(nóng)桿菌,篩選,將土壤農(nóng)桿菌與棉花細(xì)胞混合培養(yǎng),侵染,重組質(zhì)粒將抗蟲基因?qū)朊藁?xì)胞并整合到棉花的DNA上,植物組織培養(yǎng),獲得抗蟲棉,抗蟲棉的培育流程圖：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,32,重組DNA技術(shù)操作的主要

9、步驟,載體,質(zhì)粒,噬菌體,病毒,目的基因（外源基因）,基因組DNA,cDNA,人工合成,PCR產(chǎn)物,限制酶消化,開環(huán)載體DNA,目的基因,DNA連接酶,重組體,轉(zhuǎn)化,體外包裝,帶重組體的宿主,篩選,表型篩選,DNA分子雜交鑒定,個(gè)體水平,抗原抗體反應(yīng),33,1）以下說法正確的是 （ ） A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來,C,練習(xí),34,2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是 A、能復(fù)制 （ ） B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn) C、具有標(biāo)記基因 D、它是環(huán)狀DNA,D,練習(xí),35,3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（ ） A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來 B、 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶,A,練習(xí),36,4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是 （ ） A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用 B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成 C、質(zhì)