1、免疫固定電泳操作規(guī)程一 項目名稱免疫固定電泳（HYDRAGEL IMMUNOFIXATION）二 檢驗方法名稱瓊脂糖凝膠免疫固定電泳三 方法學(xué)原理血清蛋白電泳中出現(xiàn)的異常條帶主要存在于-球蛋白和-球蛋白區(qū)域，通常疑為單克隆蛋白質(zhì)并且提示丙球蛋白血癥。為鑒別異常條帶，可運用免疫固定技術(shù)。免疫固定電泳是一種簡單的技術(shù)，電泳后的蛋白質(zhì)與相應(yīng)抗體形成復(fù)合物和被固定在相應(yīng)的位置上，通過下列四個步驟：1蛋白質(zhì)在瓊脂糖凝膠內(nèi)進行電泳分離。2電泳后已分離的蛋白質(zhì)被固定并產(chǎn)生免疫沉淀：應(yīng)用固定劑和抗血清加于凝膠表面的泳道上，并讓固定劑和抗血清在凝膠內(nèi)滲透擴散。3使用吸水紙和清洗將未沉淀的蛋白質(zhì)去除，已被沉淀的蛋

2、白質(zhì)貯留在凝膠內(nèi)。4將蛋白質(zhì)染色，并將這些免疫沉淀區(qū)帶的位置與蛋白質(zhì)經(jīng)電泳后觀察到的異常蛋白區(qū)帶進行比較。為了精確識別單克隆區(qū)帶，樣品同時在六條泳道上進行測試。經(jīng)電泳后，ELP作為參考泳道以顯示電泳后的蛋白質(zhì)。其余五條泳道用于鑒定單克隆成分。通過它（們）與抗血清，(IgG)、(IgA)、(IgM)重鏈和、輕鏈（游離和非游離）反應(yīng)與否進行鑒別。該技術(shù)簡單、快速、圖象清晰，易于解釋結(jié)果。四 方法學(xué)溯源自1930年由Tiselius發(fā)現(xiàn)了移界電泳（moving boundary eectrophoresis），而后，這種技術(shù)的各種局限性已逐漸被區(qū)帶電泳（zone elecrrophoresis）所克

3、服，區(qū)帶電泳的條件和支持介質(zhì)的選擇是電泳成敗的關(guān)鍵。通過免疫化學(xué)手段觀察其電泳特性及抗原特性是鑒定某一蛋白成分最好的方法，免疫固定電泳技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的方法之一。五 儀器（一） 型號：SEBIA HYDRASYS (PN1210)（二） 分析和計算參數(shù)：1 處理量：約18個樣本/小時2 所需樣本量：10ul3 檢驗時間：約55分鐘4 重復(fù)性：有良好的批內(nèi)和批間重復(fù)性5 電泳參數(shù)：電壓0300V（可選至3000V）電流0500mA功率0100W 六 試劑及配套品（一） 試劑1 HYDRAGEL 1 IF試劑盒HYDRAGEL 2 IF試劑盒HYDRAGEL 4 IF試劑盒HYDRAGEL 9

4、 IF試劑盒（1） 商標：SEBIA（2） 包裝規(guī)格：10測試/20測試/40測試/90測試（3） 貨號：PN4301/ PN4302/ PN4304/PN43092 脫色液 （1） 商標：SEBIA （2） 包裝規(guī)格：Pack for 10100ml（3） 貨號：PN4540（4） 成分：檸檬酸 3洗滌液（1） 商標：SEBIA（2） 包裝規(guī)格：Pack for 1080ml（3） 貨號：PN4541（4） 成分：疊氮鈉 4稀釋劑（1） 商標：SEBIA（2） 包裝規(guī)格：Pack for 15ml（3） 貨號：PN4587（二） 配套品：IF試劑抗體（1） 商標：SEBIA (2 ) 包裝規(guī)

5、格：Pack for 51ml（3） PN4315七 操作步驟 開機，啟動電泳儀。 將1只（用于1，2IF），2只（用于4IF）或3只(用于9IF)點樣梳置于整表面，有數(shù)字的一端向上，在2分鐘內(nèi)完成每塊加樣梳的加樣，每孔加10ul樣品，然后齒梳向上把加樣梳放于濕盒內(nèi)5分鐘。電泳/免疫固定泳道孔號ELPGAMKLHydrasys 1 IF123456Hydrasys 2/4 IF1或3號樣本2345672或4號樣本91011121314Hydrasys 9 IF1,4或7號樣本1234562,5或8號樣本7891011123,6或9號樣本131415161718 選擇相應(yīng)的“IF”電泳程序， 從

6、包裝袋內(nèi)取出緩沖條，將其固定在電極支架背側(cè)的釘上，再取出凝膠，用薄濾紙快速輕輕地吸去凝膠表面多余的液體，在溫控板表面下1/3處加200ul蒸餾水或去離子水，將凝膠片底邊緊靠框架底邊，邊緣對齊邊線，略彎曲凝膠片慢慢放平，注意凝膠片下面勿出現(xiàn)氣泡。 自然放下支架，從濕盒中取出加樣梳并去除齒梳下的保護支架，1、2IF的點樣梳置于支架6號位，4IF的2只點樣梳則分別置于3號和9號，9IF的3只點樣梳則分別置于2，6號和10號，注意點樣梳上的數(shù)字必須面對操作者，關(guān)上電泳艙蓋，按下鍵盤左側(cè)的綠色箭頭“START”鍵，電泳開始，確保儀器右側(cè)的空氣通道不被堵塞。 電泳儀自動發(fā)出蜂鳴聲,提示電泳結(jié)束，進行免疫固

7、定操作。打開電泳蓋，將加樣梳和緩沖條丟棄，移走兩支架，用濕紙巾擦拭電極絲，將抗體加樣條裝入抗體加樣架上，按如下要求將動物血清抗體加入抗體加樣條：Hydrasys 1 IF用6孔抗體加樣條:每孔加8l抗體Hydrasys 2/4IF用15孔抗體加樣條:2人份每孔加8l抗體，4人份每孔加12l抗體Hydrasys 9 IF用18孔抗體加樣條: 每孔加8l抗體固定好抗體加樣架,將抗體加到凝膠片上。然后關(guān)上電泳艙蓋，按“Start”鍵開始免疫固定。 10分鐘后，電泳儀自動發(fā)出蜂鳴聲，提示“PAPER BLOTTING” ，移走抗體加樣架，棄去抗體加樣條，放一厚濾紙光面向下蓋于于凝膠表面, 左手固定好濾

8、紙，右手手指用力的摩擦濾紙表面，注意勿將濾紙移動，關(guān)閉電泳艙蓋，按“Start”鍵開始凝膠表面多余抗體的吸收。 3分鐘后，電泳儀自動發(fā)出蜂鳴聲，打開電泳艙蓋，移去濾紙，關(guān)閉艙蓋，按“Start”鍵開始凝膠片的干燥。 6分鐘后，電泳儀自動發(fā)出蜂鳴聲，打開電泳艙蓋，取出凝膠片，用濕紙巾擦拭溫控板，將膠片固定于凝膠支架上放入染色空間中，在檢查洗液瓶中是否有400ml洗液，染色液瓶內(nèi)是否有300ml染色液，脫色液瓶內(nèi)是否有1000ml脫色液以及是否排空了廢液瓶后，菜單上選擇染色指令，按“Start”鍵開始染色。 在染色、脫色以及干燥步驟完成后，電泳儀自動發(fā)出蜂鳴聲，取出凝膠支架，將烘干的膠片取下。八

9、臨床意義對多發(fā)性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血癥、分泌型骨髓瘤、輕鏈病、重鏈病等研究有重大意義。 1 正常人體內(nèi)有正常的免疫球蛋白分布，故免疫固定電泳圖譜可見均勻分布的IgG/A/M 2. 在IgG/A/M及Kappar、lammda的泳道上發(fā)現(xiàn)濃集的條帶即為病理性的。九 標本要求 取新鮮血清進行分析，根據(jù)臨床實驗室對各種試驗所使用的操作程序進行血清樣本的采集，樣本置于冰箱內(nèi)（28）可保存一周，若冰凍可延長保存時間至少一個月。冰凍的血清樣本加入0.02g/dl的疊氮鈉可以增加其存放穩(wěn)定性。 為避免抗原過剩引起的帶現(xiàn)象，血清于加樣前應(yīng)先作如下稀釋，并混勻。泳道血清(ul)稀釋劑(ul)蛋白電泳 (ELP)和其他免疫球蛋白固定泳道3060IgG免疫固定泳道20100 特殊情況當總免疫球蛋白的水平20g/L，稀釋劑量加倍（除了ELP泳道）當總免疫球蛋白水平5g/L，稀釋劑量減半（除了ELP泳道）冷藏或冰凍后，某些樣本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝膠）可能變得粘稠或混濁。這種樣本可能由于擴散障礙而存在點樣問題。在這樣情況下，加25ul液化劑于75ml血清中，混勻15秒。然后按規(guī)定程序繼續(xù)進行。某些單克隆蛋白質(zhì)可能因多聚體而導(dǎo)致所有的免疫固定泳道上均出現(xiàn)單克隆片段。在這樣情況下（i）準備1巰基乙醇（這種還原劑可在室溫于未封閉微管內(nèi)保存1周）（ii）加25ul還原劑于75ul血清中（